阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种慢性进行性神经退行性疾病,也是导致痴呆的主要原因｡AD占所有痴呆病例的60%~70%,其临床表现始于记忆力减退,随后发展为思维混乱､语言表达障碍和问题解决能力下降,最终丧失生活自理能力｡在病理学上,AD的标志性特征是β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)斑块的形成与沉积,以及神经原纤维缠结的出现｡AD的发病机制极其复杂,各种发病机制共同引起神经元连接的丧失和大脑组织的退化,导致记忆力下降和认知功能障碍等临床表现^[1-2]｡受伦理等多种因素的限制,人脑组织无法获取,常见动物模型也无法展现出人脑的独特结构和功能,故采用患者体细胞进行重编程而获得的诱导多能干细胞(induced pluripotent stemcell,iPSC)构建人脑类器官技术应运而生,以用来探讨与基因变异高度相关的神经疾病相关病情^[3]｡相较于传统干细胞二维模型单一的生理环境和功能特性,在特定因子作用下成功建立的人脑类器官充分表现了人类脑部的重要特征,再现了大脑区域特异性｡同时,人脑类器官携有供体者的全套遗传信息这一特点也有利于研究AD的致病机制｡总之,人脑类器官具有直观､精准､个体化的研究优势,为AD的临床诊疗研究提供了良好模型｡本文围绕人脑类器官的发展､在AD研究中的应用及相关前沿技术的研究进展进行综述,以期为AD的早期诊断与治疗提供新的思路｡

一､人脑类器官的发展史

1.全脑类器官的建立:1998年,Thomson等^[4]开发了从囊胚中分离人胚胎干细胞的技术,该技术能够获取未分化的多能干细胞,这一突破性进展标志着人类干细胞研究时代的开启｡2006年,Takahashi和Yamanaka^[5]通过逆转录4种转录因子Oct3/4､Sox2､Klf4､c-Myc(简称OSKM),成功将小鼠成纤维细胞诱导为具备干细胞特性的iPSC｡利用患者来源的iPSC分化成神经元等同基因细胞,能更好地反映出AD等神经疾病的病情进展,为深入研究疾病机制提供了新思路｡然而,面对拥有庞大神经网络和广泛功能的大脑,传统干细胞模型既不能模拟大脑三维空间中由各种调节因子和内源性信号组成的微环境,也无法模拟三维空间中细胞之间相互作用,因此,研究人员开始寻找新的方法来克服传统二维模型的种种限制^[6]｡

2013年,Lancaster等^[7]首次使用人类iPSC诱导分化出全脑类器官,并用于研究小头畸形:他们利用慢病毒递送OSKM这4种被证实的可诱导干细胞重编程因子,开发了一种不使用模式化生长因子(类器官培养过程中用于模拟和维持生物组织特定结构和功能的关键因素)的方案,将人类iPSC进行三维培养,利用旋转生物反应器,将其诱导并定向分化出具有内､中､外胚层的类胚体结构,再分化为神经外胚层和神经上皮层,最终形成类似早期胚胎大脑皮层的结构,并成功证明了小头畸形患者器官组织中神经元的过早分化｡2015年,Kirwan等^[8]利用人类iPSC成功构建了大脑类器官模型,通过模拟体内大脑皮层网络的发育和功能,证明了人脑类器官模型对人类前脑神经网络生物学机理研究的实用性｡2016年,Qian等^[9]开发了一种微型旋转生物反应器,利用人类iPSC生成前脑特异性有机体,再现了人类大脑皮层发育的关键特征,为人类大脑发育和疾病建模以及化合物测试提供了一个易于使用的多功能平台｡同年,Dang等^[10]利用人类胚胎干细胞生成的人脑类器官模拟发育中的胎儿大脑,并发现其在感染寨卡病毒(Zikavirus,ZIKV)后出现畸形和严重的生长抑制,通过分析发育中的器官组织的转录组特征,发现ZIKV感染所致的器官组织发育迟缓与Toll样受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)介导的神经发生和轴突导向失调之间有相似之处｡

2.脑区类器官的建立:随着医疗理念的发展,人脑类器官模型的精准度再次提升｡人脑类器官模型开始从全脑模型逐步演变至定向诱导的脑区类器官模型,这些脑区类器官模型能在体外培养系统中重建大脑皮层､海马､基底神经节等脑的特定区域｡2017年,Birey等^[11]通过使用钙离子通道阻断剂Nimodipine､Roscovitine,让三维分化的人类iPSC可以生成类似于皮质或皮质下的神经球体,然后在体外组装功能集成的人类前脑球体,首次模拟了中间神经元向大脑皮质的横向迁移及其与微电路的功能整合｡2019年,Kanton等^[12]利用单细胞转录组学和染色质图谱观察了干细胞衍生的人脑类器官组织,分析了人脑类器官从多能性干细胞开始,到神经外胚层和神经上皮阶段,最终分化成背侧和腹侧前脑､中脑及后脑区域的整个发育过程,揭示人类大脑发育的特征｡近年来,人脑类器官模型已经成为研究神经疾病的常见模型｡

通过抑制转化生长因子-β(TGF-β)､骨形成蛋白(BMP)和Wnt通路,人脑类器官前体的自我发育可被限制在前脑^[13-14]｡通过加入额外的模式化因子,前脑的发育将被进一步抑制,以产生类似前脑区域任何离散部分的器官组织,包括大脑皮层､视杯､海马､脉络丛､丘脑下､丘脑和下丘脑^[15-26]｡

通过抑制TGF-β和BMP通路､激活Wnt和脊髓外胚层信号(SHH)通路及应用成纤维生长因子-8(FGF8)处理则可以顺利实现中脑类器官的产生^[27]｡2016年,Jo等^[28]开发了一种从iPSC分化为人中脑类器官的方法,与动物模型或细胞模型不同的是,中脑类器官包含了电生理活动和功能成熟的多巴胺能神经元在内的特征性人类中脑神经元标记物,还产生了类似于人类黑质中神经黑色素颗粒的结构,为研究人类中脑及相关神经系统疾病提供了一个有价值的体外模型｡2019年,Kim等^[29]利用iPSC建立了三维中脑类器官模型,用于研究帕金森病中丰富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)-G2019S突变的影响,该模型不仅成功复制了LRRK2相关散发性帕金森病的关键病理特征,如α-突触核蛋白的聚集增加及清除障碍等,还发现硫氧化还原酶TXNIP在LRRK2-G2019S致病表型的发展中起关键作用,为理解LRRK2相关帕金森病的分子机制及筛选潜在治疗方案提供了更具生理相关性的研究平台｡

通过定时和联合使用包括TGF-β和BMP抑制剂､胰岛素､FGF2､FGF19和趋化性蛋白1(SDF1)在内的一系列模式化因子则可产生小脑类器官组织^[30]｡2023年,Kamei等^[31]建立了小脑退行性疾病的小鼠模型,并将iPSC衍生的小脑前体细胞移植到这个小鼠模型中,观察它们的存活和神经元突起生长情况,结果发现,移植细胞能存活并向关键小脑结构伸出神经元突起,但未完全整合,且未呈现典型浦肯野细胞形态｡这项研究对理解小脑发育机制和小脑疾病发生具有重要意义｡2024年,Atamian等^[32]通过使用TGF-β抑制剂､BMP抑制剂､Wnt激动剂､Rho相关蛋白激酶(Rhoassociated protein kinase,ROCK)抑制剂首次在全人源细胞培养系统中开发出了一种人小脑类器官,可以让包含浦肯野细胞在内的功能性小脑细胞在体外人源三维环境中长期健康存活和成熟,借助谷氨酸受体激动剂和γ-氨基丁酸(GABA)受体拮抗剂可评估小脑类器官中神经元的功能连接｡该模型提供了一个生理相关的､完全人源的系统,有望加速相关疾病治疗药物研发｡

随着生物工程技术的进步,iPSC衍生的三维脑区类器官技术的应用前景也会愈发广阔^[33]｡脑区类器官技术将会打破以往神经系统疾病和其他脑类疾病的研究瓶颈,为脑发育和神经系统疾病研究持续注入新的活力｡

二､人脑类器官在AD研究中的应用

1.AD脑类器官的建立:人脑类器官模型可以更好地模拟人大脑组织的结构和功能,相比于二维细胞和动物模型,人脑类器官更有利于研究AD的发病机制^[34]｡与传统iPSC模型相比,人脑类器官模型在重建多细胞类型共存的微环境方面具有独特优势｡人脑类器官中包含神经元､星形胶质细胞和小胶质细胞等多种细胞类型,共同构建了更接近体内状态的细胞生态系统｡研究者可以在人脑类器官中直接观察到小胶质细胞在神经炎症反应中的保护作用,以及星形胶质细胞在神经损伤中的调控功能^[35]｡这些细胞通过胞外囊泡和代谢因子等多种途径进行复杂的信号传递,对AD的进展产生关键性影响^[36]｡此外,通过整合血管内皮细胞,人脑类器官还能部分模拟脑血管病变,为研究血脑屏障损伤与AD之间的关系提供重要的实验模型,这对于深入探索AD相关的血管因素和炎症机制具有重要意义｡

2016年,Raja等^[37]用来源于AD患者的iPSC建立了人脑类器官,观察到该脑类器官以年龄依赖的方式表现出AD样表型,成为了研究AD病理机制的良好工具｡2018年,Gonzalez等^[38]发现用家族性AD或唐氏综合征患者身上提取的iPSCs建立的人脑类器官随着时间的推移会自发形成AD的病理特征｡在2024年,Choe等^[39]成功利用人类多能干细胞(hPSCs)和家族性AD突变基因,建立了模拟AD的人脑类器官模型｡尽管AD脑类器官存在一些局限,例如缺乏血管和免疫组分､成熟度不足等,但它为研究AD发病机制提供了一个贴近人类细胞系统的有效模型,也为开发其他脑部疾病模型提供了重要参考｡2024年,Liu等^[40]利用CRISPRCas9基因编辑技术,将家族性淀粉样蛋白前体蛋白(APP)突变(APPNL-G-F)引入人类胚胎干细胞,制作了表现出AD特征的APPNL-G-F脑类器官,为进一步探究载脂蛋白E(APOE)3-ch抵抗AD的机制提供了有价值的实验工具｡

2.AD病理生理学的研究:在2018年,Lin等^[41]利用CRISPR-Cas9基因编辑技术从未受影响的携带APOE3基因的细胞中制造了同源APOE4等位基因的iPSC,然后将这些iPSC分化为神经元､星形胶质细胞和类小胶质细胞,检测了APOE等位基因(APOE2､APOE3和APOE4)对与AD相关的基因表达和细胞表型的影响,结果显示APOE4基因在每种脑细胞类型中均引发了广泛的转录变化,突触功能､脂质代谢和免疫反应通路受到较大影响｡同时,携带APOE4基因的神经元表现出更多的突触数量和更高的Aβ42分泌量;携带APOE4基因的星形胶质细胞则表现出Aβ摄取功能受损以及胆固醇积累,而携带APOE4基因的小胶质细胞显示出形态变化,并且其吞噬Aβ能力有所下降｡此外,将AD患者iPSC衍生的脑细胞中的APOE4基因转换为APOE3基因,能够显著减轻多种与AD相关的病理特征,这进一步凸显了APOE4在AD发病机制中的关键作用｡在发现APOE4的关键作用后,2020年,Zhao等^[42]使用iPSC衍生的人脑类器官研究了APOE4基因对AD相关病理的影响:研究人员从健康个体和AD患者中分别获得APOE3/3和APOE4/4基因型的iPSC,并制备人脑类器官,结果显示AD患者来源的人脑类器官中Aβ和磷酸化tau蛋白水平升高,而APOE4基因型进一步加重了tau蛋白相关的病理表现,使表达APOE4/4基因型的人脑类器官表现出更严重的细胞凋亡和突触完整性降低｡进一步的转录组学分析发现,AD患者来源的人脑类器官所表达的病理特征与应激颗粒增多和RNA代谢紊乱相关,将APOE4基因转换为APOE3基因同样可以减轻与APOE4相关的表型｡2024年,Kim等^[43]通过直接重编程携带APOEε4基因的AD患者的成纤维细胞,成功生成了三维人脑类器官,并捕捉到了与APOEε4基因相关的特异性AD特征和病理｡研究人员进一步将携带突变APP的慢病毒转染人脑类器官,成功复制了家族性AD的加速性病理变化,包括Aβ42､磷酸化tau蛋白沉积和淀粉样纤维形成等｡转录组学分析还发现,携带APOEε4基因的AD患者所构建的人脑类器官与携带相同基因的AD患者尸检大脑具有高度相似的基因表达谱^[43]｡这一发现进一步证实了APOE基因与AD之间的密切关联｡2023年,Holubiec等^[44]通过诱导携带瑞典突变APP(APPswe)基因患者的皮肤成纤维细胞,生成了模拟AD的人脑类器官组织,并研究了氧化还原调控和线粒体稳态,结果发现APPswe脑类器官中与AD相关的病理特征随时间逐渐加重,包括Aβ水平升高､细胞外Aβ沉积增加和tau蛋白磷酸化增强;通过活体成像旋转盘共聚焦显微镜,研究人员观察到携带APPswe基因的人脑类器官在氧化条件下线粒体碎片增加,线粒体膜电位显著下降;此外活体成像显示,APPswe脑类器官中线粒体超氧阴离子和过氧化氢水平选择性增加,并与细胞膜和线粒体氧化还原蛋白的损伤相关联｡上述研究结果表明,APP的异常代谢引起了线粒体稳态的特定变化,从而增强了AD患者对氧化应激的易损性｡

3.AD的潜在治疗方法:2024年Choe等^[39]所建立的人脑类器官模型在表现出大量Aβ沉积､磷酸化tau蛋白水平升高和神经元退化等AD关键病理特征的同时,还通过β-分泌酶1(BACE1)抑制剂Ⅳ和γ-分泌酶抑制剂的药物验证实验进一步证实该人脑类器官模型在新药筛选领域所具有的广阔应用前景｡该AD脑类器官模型的制作策略可以应用于其他脑部疾病模型的开发,并可扩展到各种疾病｡2024年,Liu等^[40]建立的APPNL-G-F脑类器官不仅成功表现出Aβ沉积､tau蛋白高磷酸化与聚集､星形胶质细胞反应以及神经元死亡等多种AD病理特征,还在已表达罕见基因的APOE3-ch中发现了显著减少的Aβ沉积､tau蛋白相关病理､星形胶质细胞反应和神经元死亡等现象,充分证明了APOE3-ch对AD的神经保护作用｡2024年,Saha等^[45]利用野生型､杂合子和同源基因敲除同源桥接蛋白1(BIN1)的人类iPSC构建了诱导神经元和人脑类器官2种模型来研究该基因对AD的影响,结果发现,BIN1在调控谷氨酸能神经元的钙离子平衡､电活动和基因表达方面发挥着关键作用;BIN1的缺失导致钙通道表达上调和神经元电活动异常｡上述发现为AD治疗提供了新的思路,表明低剂量钙通道阻断剂可能成为延缓AD进展的潜在治疗策略｡

总之,人脑类器官在AD研究中的应用不仅为科学家提供了一个更接近人类生理状态的模型,还为探索AD的病理机制和开发新疗法提供了重要的实验依据｡这些进展为未来的AD研究和治疗策略的制定奠定了坚实的基础(表1)｡

三､人脑类器官的局限性与优化

近年来,人脑类器官研究领域取得了重大突破,其分化方案和实验技术不断优化完善｡作为模拟人类大脑早期发育的创新型模型,基于三维培养系统优化的人脑类器官展现出显著优势,其不仅能支持细胞进行更持久的发育过程,还能形成结构成熟､网络复杂的神经元系统｡与传统二维模型相比,长期培养的人脑类器官能够通过自然积累更真实地重现AD的年龄相关病理特征｡此外,研究人员通过引入外部刺激可加速AD晚期病理特征的出现,这为深入探究AD的关键病理机制提供了理想的实验模型｡

然而,在研究AD时,基于iPSC构建的人脑类器官存在一个关键的局限性:难以准确模拟AD患者衰老的大脑状态,无法完全重现AD的病理特征｡因此,如何加速AD脑类器官模型实现衰老状态已成为模型构建中的核心问题｡目前已有2种解决策略:一是通过过表达AD相关基因来加速疾病进程,使人脑类器官在较短时间内呈现出类似晚期AD的病理特征,并利用CRISPR干扰和CRISPR激活等技术修改基因组和调控基因表达水平^[46]｡二是通过添加Aβ､过氧化物等化学刺激剂来模拟AD微环境,利用过氧化物和其他氧化剂诱导神经炎症的发生,从而提前观察AD的病理特征^[47]｡随着程序性衰老诱导､表观遗传修饰以及特定基因的表达调控等人工衰老技术策略的不断发展,人脑类器官能够更好地模拟AD相关的神经退行性病变表型,从而提升了其在AD发病机制研究和药物筛选中的应用价值^[48]｡

人脑类器官的另一个局限性在于模型的拟真程度｡虽然与二维模型相比,人脑类器官在模拟疾病真实病理状态方面取得了显著进展,但与实际人脑组织相比,这些模型仍难以完全复现大脑中的细胞多样性,以及细胞间和细胞与微环境之间的复杂互作网络^[49]｡由于缺少人脑的其他组织,人脑类器官不仅会因缺乏血管化而导致内部缺氧和细胞应激,引起细胞坏死和细胞亚型分化受损,也会因模型的使用期缩短,直接影响到该模型的准确性｡为解决这些问题,研究人员已开发出多种改进策略,如改进培养技术､整合血管网络､使用生物材料支架､多细胞类型整合与微流控技术应用等策略均可增强人脑类器官模型的拟真性^[50-56]｡改进后的模型不仅使用周期得到延长,而且更好地模拟了人体生理环境,为神经系统疾病研究提供了更为可靠的实验平台^[57]｡

人脑类器官虽然突破了传统二维模型的维度限制,但在灵活性和适应性方面仍存在一定局限｡在AD的研究中,散发性AD的模型构建需求尤为迫切｡对于遗传性AD,研究人员可通过基因编辑技术在人脑类器官模型中引入APP或前体蛋白酶1/2(PSEN1/2)突变,直接呈现出与特定基因突变相关的病理特征,从而为深入研究AD早期的分子机制及早期诊断､干预策略提供重要线索｡对于受环境和遗传因素共同影响的散发性AD,需要采取更加全面的研究策略:首先,需要建立多样化的人脑类器官样本库,扩大样本数据规模,构建差异化人脑类器官模型,并结合外部环境刺激和药物暴露实验,才可更接近散发性AD的复杂病理^[49]｡其次,通过对成功建立的人脑类器官模型进行多组学分析,可为深入理解散发性AD特有的基因-环境交互机制提供独特的研究视角^[58]｡这表明散发性AD的人脑类器官研究只有采取系统性､多维度的研究策略,通过整合先进技术平台､建立完善的验证体系,并充分考虑模型局限性,才能确保研究结果的可靠性和临床相关性^[59-60]｡

尽管人脑类器官模型仍面临诸多技术挑战,但随着培养技术的不断进步,人脑类器官模型的应用前景仍旧十分广阔｡未来,人脑类器官模型不仅将在AD研究中发挥核心作用,还将为其他复杂脑部疾病的研究提供全新思路与方法｡通过持续优化和创新,人脑类器官有望为攻克AD这一医学难题提供重大帮助｡

四､人脑类器官相关的前沿技术

1.器官芯片:器官芯片是一种结合了器官样品､微流控芯片､单细胞转录组学､计算机模拟等多种技术手段的综合性研究方法,广泛应用于模拟人体内复杂细胞微环境和器官间的相互作用,是近年来诞生的一项变革性生物医学技术,在2016年被达沃斯世界经济论坛列为“十大新兴技术”之一,也是生物医学领域亟待攻克的核心技术^[61]｡面对由细胞和非细胞成分构成的干细胞龛这一特殊微环境,器官芯片的突出优点在于其对微环境的可调控能力,以及与细胞龛的高度集成｡2023年,Palma-Florez等^[62]在血脑屏障芯片上引入了一种测量单层细胞电阻的经内皮电阻系统,以评估血脑屏障的完整性和功能｡通过这一技术,他们发现靶向Aβ的纳米系统GNR-PEG-Ang2/D1能够穿越血脑屏障并到达脑实质｡这表明治疗性纳米颗粒可能成为AD治疗的潜在方法之一｡2024年,Velikic等^[55]将人脑类器官技术与微流控芯片､传感器､电磁场以及单细胞转录组学等先进技术的结合,构建了一个模拟体内复杂环境的“系统微环境”,其不仅为AD提供了新的研究途径,还有助于深入理解AD的形成过程｡

2.人工智能:人工智能是由人类创造的机器或软件系统,具备执行复杂任务的能力,可以帮助优化人脑类器官培养过程中的每一个环节,精准识别出与对照组的差异｡2021年,Esmail和Danter^[63]开发并验证了一个名为NEUBOrg的人工诱导全脑类器官模拟平台,使用了之前验证过的DeepNEU机器学习系统｡他们的目标是创建一个成本效益高且可定制的计算机模拟全脑类器官,用于模拟和研究AD的遗传学进程｡现有的体外培养的人脑类器官存在一些局限性,如缺乏功能性血脑屏障以及由于氧气和营养供给不足导致的人脑类器官中心的坏死｡NEUBOrg平台旨在通过使用经过验证的机器学习方法来模拟人脑中发现的各种神经细胞类型､脑区和皮质,从而克服这些局限性｡这是首次尝试模拟全脑类器官,这种方法可能成为神经退行性疾病建模､生物标志物识别和药物研发的重要工具｡2024年,Schröter等^[64]利用64个可跟踪脑器质性模型的1400张跨实验室图像组成了大型多样化脑器质性模型数据集,使在人工智能加持下的数据集特别适用于测试和比较类器官分析管线｡在分析不同自动化器官分析管线的优缺点和通用性时,该数据集还可以研究克隆多样性和相似性,量化不同克隆的器官形态差异,监测器官生长模式,评估分析管线在重现实际器官生长方面的性能｡这将使得人脑类器官模型的数据得到快速､精准的处理,让人脑类器官的泛用性提升､精准性提高｡

3.生物打印技术:生物打印技术是一种自动化的､分层的细胞和生物材料沉积技术,由查尔斯-赫发明^[65]｡生物打印技术主要包括激光辅助､喷墨和挤出式打印三种方法,为研究神经系统疾病提供了新的工具^[65-66]｡2021年,Zhu等^[53]通过三维打印将人脑类器官､内皮细胞和纤维母细胞融入水凝胶中,形成了具有复杂血管网络的人脑类器官｡生物打印技术为模拟人脑组织结构和功能提供了新的可能性｡通过将神经干细胞､神经前体细胞或成熟神经元打印到三维构建物中,可以制造出包含神经元和胶质细胞的神经系统模型^[67]｡这些神经系统模型可用于研究AD的发病机制,有望带来新的突破^[68]｡2024年,Abramson等^[69]研发出的AlphaFold3能够准确预测包含各种分子实体的生物分子复合物的结构,这使得生物打印技术能够更有针对性和精确性｡基于谷歌DeepMind技术的发展,蛋白质结构预测这一技术也在2024年10月9日获得诺贝尔化学奖｡

五､结语与展望

人脑类器官模型作为一种由iPSCs衍生的三维自组织结构,已经成为AD研究的重要工具｡它能够精准模拟AD患者的病理生理特征,为探索AD的分子机制､筛选潜在药物靶点､验证临床试验疗效提供了独特的平台｡这一技术不仅突破了传统动物模型的局限性,还为个体化治疗带来了新的希望｡尽管AD脑类器官模型仍存在不足,但后续随着与器官芯片､人工智能以及生物打印技术等新兴技术的结合,人脑类器官有望在AD的研究中发挥关键作用｡未来,在多学科交叉发展的推动下,人脑类器官技术有望不断改进和优化,促进AD的研究和治疗取得突破性进展｡

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明  李冉:论文撰写､资料整理;韩晓博:研究指导､论文审阅､经费支持