研究摘要

结　果

HBI的局部血管特征和微环境特点

定量分析显示，3个区域微血管分布及形态存在明显差异。此外，有趣的是，HBI区内皮细胞与LBI区内皮细胞共有1439个基因差异表达。对上调的差异表达基因进行KEGG富集分析，发现这些基因主要富集于代谢和信号转导相关通路。代表性免疫组化图像和UMAP图显示，HBI和肿瘤区域的VEGFA、EGFR和HIF-1α的表达显著高于LBI。使用HIF-1α、SLC2A1、VEGFA等基因对三个区域进行了缺氧评分，三个区域中不同细胞类型的缺氧评分比较显示出逐渐增加的趋势。不同区域的总缺氧评分结果也提示HBI与LBI有明显差异。上述结果表明，就血管特征和氧微环境而言，HBI是PBZ的一个特殊区域（图1）。

HBI和LBI表现出不同的免疫组成

小胶质细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞是脑肿瘤微环境景观的重要免疫细胞。因此，我们通过scRNA-seq分析进一步研究了肿瘤浸润免疫细胞的占比。UMAP图显示HBI区域巨噬细胞和T细胞的比例高于LBI区域。定量的免疫荧光结果显示几乎相似的结果。但3个区域间中性粒细胞浸润水平无明显差异。同样，我们分析了各区域胶质细胞（少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞）的分布，3种类型的胶质细胞在HBI区和肿瘤区之间的分布均有显著差异。随后，基于scRNA-seq数据对浸润的巨噬细胞进行拟时序分析，与LBI区域巨噬细胞相比，HBI区域有更多的巨噬细胞分布在右支。这种现象在肿瘤区域更明显。这似乎表明PBZ区巨噬细胞向原生表型分化（图2）。

HBI和LBI肿瘤细胞特征的比较

GBM是一种侵袭性和浸润性肿瘤，我们在HBI区和LBI区也观察到肿瘤细胞浸润。相比之下，HBI区域三种恶性细胞类型（AC样、MES样和NPC样）的比例高于LBI区域。值得注意的是，不同PBZ区域肿瘤细胞的基因表达谱存在巨大差异。本研究列出了来源于HBI和LBI的肿瘤细胞之间的前30个差异表达基因，与转移和肿瘤细胞增殖相关的基因，例如DCX和MKI67，在HBI区的肿瘤细胞中显著高表达。UMAP图及免疫组化分析结果均提示HBI是PBZ一个增殖潜力较大的特殊区域。因此，我们接下来从三个区域探索了CTLA4配体（CD80和CD86）、PD1配体（CD274和PDCD1LG2）和MHCI类基因在肿瘤细胞上的表达。MHC类基因（B2M、HLA-A、HLA-B和HLA-C）在HBI区域的肿瘤细胞中表达更高。有趣的是，编码CTLA4和PD1配体的基因在PBZ（HBI和LBI）区域的表达较肿瘤区域高，这也提示靶向免疫检查点途径的免疫治疗可能是切除肿瘤后，杀死PBZ浸润的肿瘤细胞的可行方法（图3）。

HBI微环境中的细胞间通信网络和特殊集群

随后，我们探索了HBI区的细胞间通信。多重免疫荧光染色提供了HBI区细胞间相互作用的空间信息。研究发现了两个配体-受体对（BSG-PPIA、PTN-PTPRZ1）在细胞间通讯中起重要作用。此外，我们还注意到一个特殊的亚群——Cluster37，它在本研究中被鉴定为AC样肿瘤细胞。Cluster37中的细胞大多数来自HBI区域，一小部分来自肿瘤区域，但没有来自LBI区域的细胞。与GBM恶性进展相关的几个基因——包括EGFR和AQP4，在Cluster37中显著上调。KEGG分析还发现，上调基因大多富集在与癌症相关的通路中。值得注意的是，这些基因还富集到调节干细胞多能性的信号通路。总之，这些发现表明HBI区域中可能存在独特的肿瘤细胞亚群（图4）。

胶质瘤干性细胞在不同区域的分布

我们通过scRNA-seq分析和免疫荧光染色进一步探索了胶质瘤干性细胞（Glioma stem cells, GSC）标记基因的表达分布。从近期文献中共筛选出15个GSC标记基因。我们用气泡图可视化了10个Cluster（鉴定为恶性细胞）中GSC标记基因的表达。结果表明，GSC标记基因在Cluster 13、10和14中表现出较高的表达。因此，在本研究中，这些Clusters被视为GSC。根据scRNA-seq数据计算出10例患者中3个区域的GSC比例，统计分析结果显示不同区域的GSC比例差异显著。不同区域的基因表达气泡图也显示HBI区域GSC标记基因比LBI区域有着更高的表达水平。然后用3种GSCs标记物（SOX2、OLIG2和NESTIN）免疫染色，可视化GCS在不同区域的分布，定量分析结果与scRNA-seq数据一致（图5）。

图5. The characteristics and distribution of GSCs in different regions.

总　结

PBZ是GBM复发的主要部位。因此，有必要将研究焦点从肿瘤核心转移到肿瘤外围。进一步深入了解PBZ特性，并针对性的局部治疗是控制胶质瘤复发的关键。本研究显示肿瘤侵袭和复发可能发生在HBI区域，因此，对于手术切除后的PBZ区域的靶向治疗（例如，放射治疗或光动力治疗），HBI是值得关注的区域。本研究也为进一步探讨其他实体瘤的PBZ异质性提供了有益的参考。

第一作者简介

● 神经外科主治医师

● 博士研究生学历

● 临床医学博士后在站

● 目前累计发表SCI论文50余篇（其中第一作者身份10篇），主持省厅级课题1项，参与国家级省部级课题多项；获河南省科学技术进步三等奖1项，河南省医学科技二等奖1项，中国肿瘤学大会“青年优秀论文三等奖”1项，第一发明人身份获国家实用新型专利1项

通讯作者简介

● 神经外科科室主任

● 二级教授/博士研究生导师

● 中国抗癌协会理事会理事、中国抗癌协会肿瘤光动力治疗专业委员会第二届主委、外科学组组长，中国临床肿瘤学会肿瘤光动力治疗专家委员会副主任委员，中国医师协会神经外科分会委员、脑胶质瘤专业委员会委员、周围神经专委会常委，中国卒中学会脑出血微创治疗专业委员会常委等

● 发表SCI收录论文60余篇，影响因子大于300；作为主编、副主编参与撰写多部相关指南和规范；主持国家级科研课题6项（国家自然科学基金4项，中国博士后基金1项，2009年度教育部新世纪优秀人才支持计划1项）和省市级课题多项；获得中国发明创业奖创新奖一等奖1项，黑龙江省政府科技进步二、三等奖多项，省高校科学技术奖1项，省医药卫生科技进步一等奖1项，省卫生厅医疗新技术奖多项