导读：
在阿尔茨海默病（AD）领域，早期诊断意义重大。当前，脑脊液中Aβ肽和p-tau蛋白检测是重要诊断手段，血浆检测因微创等优势在研究中兴起。但tau蛋白磷酸化复杂，其生理病理作用及多位点磷酸化检测和诊断价值待探索。意大利佩鲁贾大学 Anna L. Wojdała团队近期在《Nature Communications》期刊发表了题为“Immunoassay detection of multiphosphorylated tau proteoforms as cerebrospinal fluid and plasma Alzheimer’s disease biomarkers” 的文章。该团队研究人员假设双位点磷酸化p-tau蛋白诊断价值更高，并开发两种免疫分析法检测脑脊液和血浆中特定双位点磷酸化tau蛋白。技术上，两种方法性能良好。研究对两个队列深入研究，结果显示多数相关蛋白水平在AD组相对神经系统疾病对照组显著升高，血浆p-tau181&231无此差异。诊断性能上，血浆p-tau217&231 出色，优于单一位点磷酸化检测。该研究证实p-tau217&231 作为AD生物标志物潜力，提示脑脊液和血浆中tau蛋白磷酸化模式有差异。未来需更大规模研究探索tau蛋白磷酸化，推动 AD 早期诊断与治疗发展。
阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病，对全球公共健康的冲击日益加剧。随着首批可改变疾病进程的疗法逐渐问世，尽早诊断阿尔茨海默病，尤其是在临床症状出现之前，显得尤为重要。通过脑脊液（CSF）检测β-淀粉样蛋白（Aβ）肽和不同位点磷酸化tau蛋白（主要为苏氨酸181位点（p-tau181）、205位点（p-tau205）、212位点（p-tau212）、217位点（p-tau217）和231位点（p-tau231）），可以高度准确地识别阿尔茨海默病，有效区分AD患者与对照组及其他神经退行性疾病。
得益于超灵敏技术的发展，这些技术扩展了体液中可测量蛋白质浓度的范围，过去十年间，探索血液衍生基质中AD生物标志物诊断潜力的研究显著增加。与脑脊液采集相比，血液采样是一种侵入性较小的程序，无需特定的专业知识或设备，广泛的医疗专业人员均可操作。重要的是，血液允许重复采样，这对于纵向研究以及监测疾病修饰疗法的效果至关重要。与CSF中的发现类似，在血浆中测量的几种磷酸化形式的tau（p-tau181、p-tau205、p-tau212、p-tau217、p-tau231）在AD连续体的不同阶段具有很高的诊断价值。然而，已鉴定出多种tau蛋白的翻译后修饰（PTMs），包括超过50个磷酸化位点，其在生理和病理中的重要性尚未完全理解。值得注意的是，最近的研究提出了tau蛋白过度磷酸化可能是随着阿尔茨海默病（AD）进展而加剧的生理过程这一问题。此外，有人提出了一种针对AD的tau蛋白分期模式，其中特定位点的磷酸化变化随疾病进展而发生，并随着时间推移呈现不同的轨迹。进一步而言，同时测量不同位点磷酸化的tau蛋白的诊断和预后价值尚未被探索，以及与单一磷酸化位点的tau蛋白形式相比的附加价值也未明确。
为了研究多磷酸化tau蛋白作为阿尔茨海默病（AD）生物标志物在人体体液中的潜力，作者团队开发了两种夹心免疫分析方法，分别检测同时在T181和T231位点磷酸化的tau蛋白（p-tau181&231；C231D181分析法）以及在T217和T231位点磷酸化的tau蛋白（p-tau217&231；C231D217分析法）。随后，他们在来自不同临床阶段的阿尔茨海默病患者、额颞叶痴呆（FTD）患者以及神经疾病对照组（NDC）的匹配脑脊液和血浆样本中测量了p-tau181&231和p-tau217&231。
结果1 夹心免疫分析方法技术验证
C231D181 检测的技术验证包括了 8 点标准曲线，其中肽类标准品稀释液（1:2）的浓度范围从 80 pg/mL 到 1.25 pg/mL，并包含一个不含肽类标准品的空白对照（补充表 2）。C231D181 检测的定量下限 (LLOQ) 和定量上限 (ULOQ) 分别为 1.25 pg/mL 和 80 pg/mL（补充表 3）。批内和批间变异系数 (CV%) 分别为 10% 和 3%（补充表 4, 5）。在两台不同仪器上评估的稀释线性结果良好（仪器 1 的 CV%：11%，仪器 2 的 CV%：6%；测试了 1x、2x、4x、8x、16x 和 32x 稀释的加标样品）（补充表 6）。C231D181 检测的加标回收率评估显示中等回收率：低加标为 69%，高加标为 87%（补充表 7）。使用单磷酸化肽混合物进行检测时，结果显示为空白信号水平，表明双磷酸化是形成免疫复合物并产生信号的必要条件（补充表 8）。C231D217 检测的 8 点标准曲线包括肽类标准品稀释液（1:3），其浓度范围从 40 pg/mL 到 0.05 pg/mL，并包含一个不含肽类标准品的空白对照（补充表 9）。C231D217 检测的定量下限 (LLOQ) 和定量上限 (ULOQ) 分别为 0.05 pg/mL 和 40 pg/mL（补充表 10）。批间和批内变异系数 (CV%) 分别为 7% 和 4%（补充表 11, 12）。在两台不同仪器上评估的稀释线性结果良好（仪器 1 的 CV%：2%，仪器 2 的 CV%：3%；测试了 2x、4x、8x、16x 和 32x 稀释的加标样品）（补充表 13）。C231D217 检测的加标回收率评估结果显示：低加标为 72%，高加标为 84%（补充表 14）。
两个队列的人口统计学和临床参数见表 1。除了预期的MMSE和CDR差异外，发现队列和验证队列中不同临床组别的年龄差异也具有统计学意义（发现队列：NDC与MCI-AD p≤0.01，NDC与AD-痴呆 p≤0.001；验证队列：NDC与pre-AD p≤0.05，NDC与AD-痴呆 p≤0.01，AD-痴呆与FTD p≤0.05）。在所有队列中，各临床组别之间的性别差异无统计学意义。
表1 | 发现队列和验证队列的人口统计学和临床特征概况
如在发现队列中所评估，血浆p-tau181&231 与脑脊液和血浆中的p-tau181、p-tau231或其脑脊液对应物（脑脊液p-tau181&231）无相关性（图 1a）。相反，脑脊液和血浆中的p-tau217&231 均与脑脊液和血浆中的 p-tau217 和 p-tau231 水平表现出强烈的正相关（Spearman 相关性分析）（图 1a, b）。
图1 | 脑脊液和血浆中 p-tau181、p-tau217、p-tau231、p-tau181&231 以及 p-tau217&231 之间的相关性
P-tau181、P-tau231和P-tau181&231：在发现队列中，与无认知障碍（NDC）组相比，轻度认知障碍阿尔茨海默病（MCI-AD）和阿尔茨海默病痴呆（AD-dem）组的脑脊液（CSF）和血浆中的p-tau181、p-tau231以及CSF中的p-tau181&231水平均显著升高（图 2a）。血浆中的p-tau181&231水平在NDC组和阿尔茨海默病连续体各组之间没有显著差异（图 2b，补充图2）。
在发现队列中测量的CSF p-tau181、p-tau231和p-tau181&231在区分NDC和阿尔茨海默病方面表现出高准确性（受试者工作特征曲线下面积（AUC）范围为0.986–1.000；补充表15）。在血浆中，p-tau231在区分NDC与MCI-AD及AD-dem方面表现最佳（血浆p-tau231 NDC vs. MCI-AD AUC = 0.925，95% CI 0.840–1.000；NDC vs. AD-dem AUC = 0.947，95% CI 0.872–1.000），其次是p-tau181（血浆p-tau181 NDC vs. MCI-AD AUC = 0.877，95% CI 0.761–0.993；NDC vs. AD-dem AUC = 0.943，95% CI 0.857–1.000）（补充表15, 16）。对于血浆p-tau181&231的ROC分析显示，在区分NDC与MCI-AD（AUC = 0.514，95% CI 0.320–0.709）和NDC与AD-dem（AUC = 0.579，95% CI 0.383–0.775）方面表现较差（补充表15, 16）。
在发现队列中进行的中位浓度倍数变化分析（AD连续组的中位浓度除以对照组的中位浓度）显示，脑脊液和血浆中的p-tau231具有最高的倍数变化（补充表17）。所有脑脊液比较均显示出较大的标准化效应量（Cohen’s d >0.8）（图 2a）。在血浆中，p-tau231显示出较大的效应量，而p-tau181显示出中等效应量（d>0.5），而p-tau181&231的效应量则微乎其微（d< 0.2）（图 2b）。对于p-tau217、p-tau231和p-tau217&231，在发现队列中，与对照组相比，MCI-AD和AD-痴呆组的脑脊液和血浆水平均显著升高（图2，补充图2）。
图2 | 在发现队列中，脑脊液和血浆 p-tau181、p-tau217、p-tau231、p-tau181&231 以及 p-tau217&231 的诊断性能
针对发现队列中脑脊液 p-tau217、p-tau231 及 p-tau217&231 进行的 ROC 分析显示，这些指标在区分正常认知 (NDC) 和阿尔茨海默病连续阶段 (AD continuum stages) 方面具有高准确性（AUC 范围为 0.986–1.000；补充表 15）。在血浆中，p-tau217&231 在区分 NDC 与轻度认知障碍阿尔茨海默病 (MCI-AD)（AUC = 0.993，95% CI 0.974–1.000）以及 NDC 与阿尔茨海默病痴呆 (AD-dem)（AUC = 0.964，95% CI 0.898–1.000）方面表现出最佳能力（补充表 15, 16）。在针对 NDC 与所有合并的阿尔茨海默病连续阶段组（MCI-AD 和 AD-dem）进行的 ROC 分析中，血浆 p-tau217&231 的名义 AUC 最高（AUC = 0.979，95% CI 0.945–1.000），在所比较的血浆标志物中表现最优，但与血浆 p-tau217 或 p-tau231 的 AUC 值相比无统计学显著差异（图 3a）。根据患者脑脊液 AT 档案进行的 ROC 分析显示，血浆 p-tau217&231 在所比较的检测方法中具有最高的名义 AUC 值（A+ vs. A- AUC = 0.979，95% CI 0.945–1.000；A + T+ vs. 其他 AUC = 0.973，95% CI 0.934–1.000），并产生了最高的标准化效应量（补充图 1）。在发现队列中，p-tau217&231（C231D217 检测）在脑脊液和血浆中的中位浓度变化倍数（AD 连续阶段组 vs. NDC）高于所有其他标志物（补充表 17）。在脑脊液和血浆的所有临床组比较中均观察到较大的标准化效应量（图 2）。
图3 | 血浆 p-tau217、p-tau231 及 p-tau217&231 的 ROC 分析
P-tau181、P-tau231和P-tau181和231：在验证队列中，与对照组相比，AD前、MCI-AD和AD-dem组的CSF ptau181、P-tau231和P-tau181和231水平持续升高（P≤0.0001）（图4，补充图2）。NDC和FTD之间的CSF p-tau181、p-tau231和p-tau181和231水平没有显著差异（图4，补充图2）。
针对脑脊液中 p-tau181、p-tau231 和 p-tau181&231 的 ROC 分析在验证队列中进行，确认了这三种检测方法在区分 NDC（无认知障碍）与 MCI-AD（轻度认知障碍阿尔茨海默病）以及 NDC 与 AD-dem（阿尔茨海默病痴呆）方面具有高准确性（AUC 范围 = 0.991–1.000；补充表 15, 16）。此外，NDC 与 pre-AD（阿尔茨海默病前期）的 ROC 分析也显示每种检测方法均获得了较高的 AUC 值（脑脊液 p-tau181：NDC vs. pre-AD AUC = 0.970，95% CI 0.929–1.000；脑脊液 p-tau231 AUC = 0.991，95% CI 0.972–1.000；脑脊液 p-tau181&231 AUC = 0.982，95% CI 0.951–1.000）。测量脑脊液中的 p-tau181、p-tau231 和 p-tau181&231 可有效区分 AD-dem 和 FTD（额颞叶痴呆）（AUC 范围 = 0.968–0.978）（补充表 15）。
在验证队列中，对 AD 连续体各组与 NDC 的中位浓度倍数变化分析确认了在发现队列中观察到的趋势，即脑脊液和血浆 p-tau231 显示最高的中位浓度倍数变化（脑脊液 p-tau231：发现队列 AD-dem/NDC = 5.39；验证队列 AD-dem/NDC = 5.72；血浆 p-tau231：发现队列 AD-dem/NDC = 6.02；验证队列 AD-dem/NDC = 2.56；补充表 17）。最大的标准化效应量出现在脑脊液 p-tau181、p-tau231 和 p-tau181&231 以及血浆 p-tau231（图 4）。血浆 p-tau181 在所有临床组比较中表现出中等效应量（pre-AD/NDC = 0.40，MCI-AD/NDC = 0.26，AD-dem/NDC = 0.29）（图 4）。
在验证队列中，脑脊液和血浆中的 p-tau217、p-tau231 以及 p-tau217&231 水平在前阿尔茨海默病（pre-AD）、轻度认知障碍阿尔茨海默病（MCI-AD）和阿尔茨海默病痴呆（AD-dem）组中均显著升高，与对照组相比（图 4，补充图2）。而脑脊液或血浆中的 p-tau217、p-tau231 和 p-tau217&231 水平在非痴呆对照（NDC）和额颞叶痴呆（FTD）之间没有显著差异（图 4）。
图4 | 验证队列中脑脊液和血浆 p-tau181、p-tau217、p-tau231、p-tau181&231 以及 p-tau217&231 的诊断性能
针对验证队列中测量的脑脊液 p-tau217、p-tau231 和 p-tau217&231 进行的 ROC 分析确认了这三种检测方法在区分 NDC 和 AD 连续阶段方面具有高准确性（AUC 范围 = 0.927–1.000），其中脑脊液 p-tau217 在所有比较中显示出最高的 AUC 值（补充表 15）。ROC 分析显示，脑脊液 p-tau217、p-tau231 和 p-tau217&231 在区分 AD-痴呆与 FTD 方面也非常有效（AUC 范围 = 0.934–0.978）（补充表 15）。在血浆中，用于区分NDC和每个AD连续阶段的ROC分析显示，血浆p-tau217和231的标称AUC值高于血浆p-tau217和p-tau231（补充表15）。与血浆p-tau217 NDC与MCI-AD和NDC与AD dem的AUC相比，观察到显著差异，但与p-tau231相比没有差异（补充表16）。血浆ptau217、p-tau231和p-tau217&231的测量可以有效地区分AD dem和FTD（AUC范围=0.803-0.904）（补充表15）。
在NDC与所有联合AD连续组（AD前、MCI-AD和AD dem）的ROC分析中，血浆p-tau217和231的准确度最高，AUC为0.968 95%CI 0.929–1.000，与血浆p-tau218和p-tau231的AUC有显著差异（图3）。
血浆p-tau217&231在区分A+与A-组（AUC = 0.914，95% CI 0.855–0.973）以及A+ T+与其他组（AUC = 0.894，95% CI 0.831–0.957）时，也获得了最高的名义AUC值，这些分组是根据脑脊液AT特征定义的（补充图1），并且产生了最高的标准化效应量。
在验证队列中，血浆中位浓度倍数变化（AD连续组与NDC对比）的分析确认了发现队列中观察到的趋势，显示p-tau217和p-tau231的倍数变化值高于其他标志物（血浆p-tau217和p-tau231倍数变化：发现队列AD-痴呆/NDC = 13.63；验证队列AD-痴呆/NDC = 20.6；补充表17）。在脑脊液中，发现队列中p-tau217和p-tau231的最大中位浓度倍数变化为18.13（脑脊液p-tau217和p-tau231发现队列AD-痴呆/NDC = 18.13），而验证队列中p-tau217的最大中位浓度倍数变化为8.51（脑脊液p-tau217验证队列AD-痴呆/NDC = 8.51）（补充表17）。对于脑脊液和血浆中的p-tau217、p-tau231以及p-tau217和p-tau231组合，所有临床组比较均显示出较大的标准化效应量（图4）。
作者团队提出了一种同时靶向两个不同位点磷酸化tau的方法——T181和T231（ptau181和231；检测C231D181）或T231和T217（p tau217和231；测定C231D217）（图 5）。研究结果表明，CSF具有良好的AD生物标志物潜力，但血浆p-tau181和231没有。另一方面，作者团队提出ptau217和231作为一种极具前景的CSF和血浆生物标志物，其在血浆中的表现可能甚至优于血浆中的p-tau217或p-tau231。CSF和血浆之间观察到的差异表明了基质特异性蛋白质加工，值得进一步研究，包括评估tau蛋白在与已分析位点不同的位点同时磷酸化，并将临床验证扩展到更大的队列。
图5 | 免疫测定的设计
原文链接：
Wojdała AL, Bellomo G, Gaetani L, Teunissen CE, Parnetti L, Chiasserini D. Immunoassay detection of multiphosphorylated tau proteoforms as cerebrospinal fluid and plasma Alzheimer's disease biomarkers. Nat Commun. 2025 Jan 2;16(1):214.
编 译 / 程赫镭
校 审 / 蔡玉洁
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