【中国声音】原癌基因酪氨酸激酶c-SRC通过重塑脂肪酸合成促进胶质母细胞瘤进展 - 脑医汇 - 神外资讯

2024年8月28日，王占祥教授团队和李勤喜教授团队在Nature Communications杂志在线发表了题为“The proto-oncogene tyrosine kinase c-SRC facilitates glioblastoma progression by remodeling fatty acid synthesis”的文章，阐述了胶质瘤脂肪酸合成代谢的新机制。本研究发现，原癌基因c-SRC在胶质瘤中广泛激活，通过磷酸化激活ACSS2促进乙酸生成乙酰辅酶A，同时磷酸化抑制ACLY使柠檬酸分流至IDH1催化反应，促进NADPH产生。c-SRC通过“on-off”方式，有效调控ACSS2和ACLY来重塑脂肪酸合成，确保同时提供乙酰辅酶A和NADPH以满足胶质瘤细胞脂肪酸合成的需求。该项研究揭示c-SRC调控ACSS2和ACLY这两个“开关”的分子机制，为理解胶质瘤代谢灵活性提供了一个范例。

胶质瘤表现出高度的侵袭性和复发率，它被认为是最难治愈的肿瘤之一。早在20世纪20年代，Otto Warburg发现即便是在氧气充足的情况下，肿瘤细胞更倾向于利用葡萄糖产生能量，这就是著名的瓦伯格效应（Warburg effect）。大量证据表明代谢重编程是肿瘤的一个显著特征。除了氧糖酵解之外，肿瘤的另一个代谢特征是脂质代谢的增强，尤其是脂肪酸的从头合成。脂肪酸合成的增加对快速增殖的肿瘤细胞构建大量生物膜至关重要，对与肿瘤的发生发展具有重要的生物学意义。

在相当长一段时间内，细胞质中的乙酰辅酶A被认为是通过柠檬酸裂解酶ACLY利用柠檬酸作为底物，催化柠檬酸裂解这一经典的生物反应过程生成的。近年来，新的研究表明了一条新的途径，即短链酰基辅酶A合成酶家族成员乙酰辅酶A合成酶（ACSS2）通过利用1分子ATP和辅酶A将乙酸转化为乙酰辅酶A。这一发现为细胞质乙酰辅酶A合成提供了一条替代途径，揭示了乙酸在支持肿瘤进展中的重要功能，即通过补充乙酰辅酶A来促进脂肪酸合成。

在本研究中，作者观察到c-SRC在胶质瘤中广泛激活，通过磷酸化ACSS2的Tyr530和Tyr562位点激活ACSS2，促进乙酸合成乙酰辅酶A。令人惊讶的是，c-SRC同时还磷酸化ACLY的Tyr682位点抑制ACLY酶活性。这种抑制作用将柠檬酸转向由IDH1催化的NADPH生成，为脂肪酸合成提供还原力。总而言之，c-SRC通过调控ACSS2和ACLY，同时满足胶质母细胞瘤细胞在脂肪酸合成过程中对乙酰辅酶A和NADPH的需求。该研究揭示了c-SRC促进胶质母细胞瘤进展的详细机制，并为靶向抑制c-SRC治疗胶质瘤提供了重要依据。

c-SRC在胶质瘤中广泛激活，且与胶质瘤的恶性程度密切相关

作者通过用c-SRC Tyr419磷酸化抗体（p-c-SRC）检测c-SRC的磷酸化水平，确定33个临床神经胶质瘤样本中的c-SRC激活情况。如图所示1.1，c-SRC在超过80%的胶质瘤样本中被激活，尤其是在高级别神经胶质瘤（III级和IV级）中，表明c-SRC激活与胶质瘤的恶性程度密切相关。

图1.1 c-SRC在胶质瘤中广泛激活，与胶质瘤的恶性程度密切相关。（A）临床胶质瘤样品的蛋白质印迹分析，以确定c-SRC的表达和激活（p-c-SRC）。（N：正常组织；世界卫生组织（WHO）神经胶质瘤分级：I-IV）。（B）根据临床组织中图像的光密度（ODI）分析c-SRC激活与胶质瘤恶性程度（WHO：I-IV）之间的相关性（患者3–35，n=33）。

通过原位颅内成瘤实验，以评估c-SRC在胶质瘤中的致癌潜力。c-SRC敲低显著降低U87细胞的小鼠颅内肿瘤的形成（图1.2）。

图1.2 c-SRC促进胶质瘤的形成。在颅内输注1×10⁵ U87细胞，1个月后拍摄脑切片的MRI图像（左），根据肿瘤直径计算肿瘤体积大小（右）。

c-SRC促进细胞利用乙酸合成脂肪酸

如图2A所示，利用[2-¹³C]-乙酸培养细胞，以直接分析c-SRC对乙酸的利用和回收的影响。敲低c-SRC，乙酸来源的乙酰辅酶A（acetyl-CoA，M+1）和丙二酰辅酶A（M+1）显著降低（图2B，2C）。与以上发现一致，c-SRC敲低后13C标记的乙酸进入到肉豆蔻酸（C14:0）、棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）显著减少(图2D）。总而言之，c-SRC通过利用乙酸，促进脂肪酸的从头合成。

图2. c-SRC促进细胞利用乙酸合成脂肪酸。（A）[2-¹³C]-乙酸的代谢示意图（红点表示¹³C）。（B）U87细胞中敲低C-SRC，用含有5 mM [2-¹³C]-乙酸的完全培养基培养24小时。分析U87细胞中[2-¹³C]-乙酸来源的乙酰辅酶A（M+1）的含量。（C）c-SRC敲低的U87细胞中丙二酰辅酶A的水平。（D）用含有5 mM [2-¹³C]-乙酸的完全培养基培养c-SRC敲低的CHG-5细胞3天，提取游离脂肪酸，并使用GC-MS分析[2-¹³C]-乙酸来源的脂肪酸的含量（M+1）。

c-SRC磷酸化ACSS2，促进乙酸合成脂肪酸

为了研究c-SRC是否通过调节ACSS2促进脂肪酸合成中乙酸的利用，作者对过表达的蛋白进行了相互免疫共沉淀（co-IP）测定，以检测c-SRC和ACSS2之间的相互作用。实验结果发现c-SRC和ACSS2存在相互作用（图3.1 A）。作者进行了一系列实验来确定c-SRC是否通过磷酸化调节ACSS2。过表达的ACSS2可以被c-SRC磷酸化，用小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）处理细胞裂解物后，这种磷酸化显著地降低（图3.1 B）。利用LC-MS鉴定c-SRC特异性磷酸化ACSS2的酪氨酸位点（图3.1 C）。该分析确定了Tyr530和Tyr562是ACSS2上的两个c-SRC磷酸化位点（图3.1 D）。当ACSS2-Y530F/Y562F（ACSS2-DMut）双突变后几乎完全抑制了ACSS2的磷酸化。同时，ACSS2的这两个磷酸化残基在哺乳动物中高度保守（图3.1 E）。

图3.1 c-SRC与ACSS2结合并磷酸化ACSS2 Tyr530和Tyr562位点。（A）在U87细胞中转染ACSS2和c-SRC。转染24小时后，裂解细胞，并用Flag M2beads进行免疫沉淀（IP）实验，WB分析ACSS2和c-SRC之间的相互作用。（B）用HA-ACSS2和Flag-c-SRC转染U87细胞，然后用HA beads进行免疫沉淀实验。在小牛肠道碱性磷酸酶（CIAP）处理或不处理的情况下检测ACSS2的酪氨酸磷酸化。（C）ACSS2 Tyr530和Tyr562磷酸化的质谱图。（D）在U87细胞中共同转染HA-c-SRC和Flag-ACSS2-WT或Flag-ACS2-DMut（双突变，Y530F+Y562F）。在用Flag M2 beads进行免疫沉淀后，用相应的抗体检测ACSS2的Tyr530、Tyr562和总酪氨酸（p-Tyr）的磷酸化水平。（E）Snapgene软件比对不同物种的ACSS2 Tyr530和Tyr562残基的保守性。

在阐明了c-SRC对ACSS2的磷酸化作用后，作者继续探索这种磷酸化修饰对ACSS2功能的影响。作者利用[2-¹³C]-乙酸培养U87细胞，并利用LC-MS和GC-GC-MS定量分析乙酸来源的乙酰辅酶A（M+1）、丙二酰辅酶A（M+1）和脂肪酸（肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸，M+1）。结果表明，c-SRC-WT与ACSS2的共转时，显著激活了ACSS2的活性，促进乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和脂肪酸的产生（图3.2 A–C）。当ACSS2两个磷酸化位点突变时，c-SRC对其激活程度随之降低；当两个位点都突变后，c-SRC的激活作用完全消失（图3.2 D）。值得一提的是，ACSS2-DMut双突变体仍然保持了其基本的活性（图3.2 E）。以上实验结果表明，c-SRC磷酸化Tyr530和Tyr562以促进ACSS2利用乙酸合成乙酰辅酶A。

图3.2 c-SRC磷酸化激活ACSS2促进乙酸转化为脂肪酸。（A–C）在U87细胞中转染表达ACSS2、c-SRC-WT和c-SRC-KD的质粒。转染6小时后，将细胞转移到含有5 mM [2-¹³C]-乙酸的完全培养基中进行24小时的细胞培养。通过LC-MS分析乙酸来源的乙酰CoA（M+1）、丙二酰CoA（M+1）和脂肪酸的含量。（D）将c-SRC和不同ACSS2的突变体转染U87细胞。转染6小时后，将细胞在含有5 mM[2-¹³C]-乙酸盐的新鲜完全培养基中再培养24小时。通过LC-MS检测[2-¹³C]-乙酸来源的乙酰辅酶A（M+1）的含量。（E）将回补ACSS2的细胞用含有5 mM [2-¹³C]-乙酸的完全培养基培养3天。GC-MS测定[2-¹³C]-乙酸来源的脂肪酸（C14:0、C16:0和C18:0）（M+1）。

c-SRC磷酸化抑制ACLY，为脂肪酸合成提供NADPH

如图4A所示，细胞质乙酰辅酶A的来源有两种不同的产生途径。在确定了c-SRC在磷酸化激活ACSS2促进乙酸转化为乙酰辅酶A后，作者的研究重点转向了ACLY。过表达IP实验证明了ACLY和c-SRC之间存在特定的相互作用（图4B）。LC-MS鉴定发现Try682和Try854是ACLY上两个潜在的c-SRC磷酸化位点，构建了ACLY的这两个位点的突变体（Y682F和Y854F），并发现Y682F突变后显著降低了c-SRC对ACLY磷酸化（图4C）。该结果表明，c-SRC磷酸化ACLY的Tyr682。

令人惊讶的是，ACLY酶活实验发现c-SRC能显著抑制其酶活性（图4D）。c-SRC磷酸化ACLY显著降低V_max来抑制ACLY（图4E）。进一步发现，c-SRC磷酸化抑制ACLY，将柠檬酸转向IDH1催化的脱氢反应中，促进NADPH的产生，为脂肪酸的从头合成提供还原当量（图4F）。

图4. c-SRC磷酸化抑制ACLY，为脂肪酸合成提供NADPH。（A）脂肪酸从头合成过程中胞质乙酰辅酶A产生示意图。（B）将HA-ACLY和Flag-C-SRC共同转染到U87细胞中。裂解细胞并用Flag M2beads富集Flag标记的c-SRC。通过蛋白质印迹分析二者的相互作用。（C）在HEK-293T细胞中共转HA-c-SRC和ACLY突变体（Y854F或Y682F）。转染24小时后，IP-Flag ACLY分析其酪氨酸磷酸化。（D）Flag-ACLY与HA-c-SRC-WT或c-SRC-CA共转。转染24小时后，裂解细胞并进行IP-Flag实验。Flag-ACLY经Flag peptide洗脱并用于苹果酸脱氢酶（MDH）偶联的ACLY活性测定。同时，WB分析ACLY的蛋白表达和酪氨酸磷酸化。（E）用不同浓度的柠檬酸进行ACLY活性测定，以分析c-SRC介导的磷酸化对ACLY的酶促反应的影响。基于此结果，利用双倒数曲线计算c-SRC磷酸化后ACLY的V₀和K_m值。（F）在ACLY敲低U87和CHG-5细胞中回补ACLY-WT（re-ACLY-WT）和ACLY-Y682F（re-ACLY-Y682F）。然后通过LC-MS分析细胞的NADPH水平。

c-SRC通过调控ACSS2和ACLY优化乙酰辅酶A和NADPH产生，促进脂肪酸的形成和胶质瘤的发生

作者对ACLY和ACSS2进行了双敲（shACSS2+shACLY），随后在双敲细胞中回补ACSS2-WT和ACLY-WT（re-ACSS2WT+ACLYWT，缩写为re-WT+WT）或ACSS2和ACLY的c-SRC无响应的突变体（re-ACSS2Y530F/Y562F+ACLYY682F，缩写为re-Mut+Mut）（图5A）。用全标记的葡萄糖（[U-¹³C]-glucose）培养细胞，检测发现re-Mut+Mut细胞中乙酰辅酶A和NADPH都降低，葡萄糖来源的脂肪酸也减少（图5B, 5C）。相应地，回补突变体的re-Mut+Mut细胞的增殖能力也显著降低（图5D）。这些实验证实了c-SRC通过共同调节ACSS2和ACLY来优化乙酰辅酶A和NADPH的产生，促进葡萄糖转化为脂肪酸。

随后，在小鼠脑中输注re-WT+WT和re-Mut+Mut U87细胞来进行原位成瘤实验。MRI成像表明re-Mut+Mut细胞形成的肿瘤明显小于re-WT+WT细胞产生的肿瘤。这一结果表明，c-SRC通过调控ACSS2和ACLY促进胶质瘤的形成。

图5. c-SRC通过调控ACSS2和ACLY优化乙酰辅酶A和NADPH产生，促进脂肪酸的形成和胶质瘤的发生。（A）在U87和CHG-5细胞中构建ACSS2和ACLY的双重敲低细胞（shACSS2+shACLY，D-KD），分别回补ACSS2-WT和ACLY-WT（缩写为re-WT+WT）或ACSS2-Y530F/Y562F和ACLY-Y682F（缩写为re-Mut+Mut）。（B）用含有10 mM [U-¹³C]-葡萄糖的培养基培养（A）中所示的re-WT+WT和re-Mut+Mut的U87细胞24小时，LC-MS检测[U-¹³C]-葡萄糖来源的乙酰辅酶A（M+2）。（C）LC-MS检测re-WT+WT和re-Mut+Mut U87细胞中的NADPH水平。（D）用含有20 mM [U-¹³C]-葡萄糖的新鲜培养基培养re-WT+WT和re-Mut+Mut U87细胞3天，GC-MS分析[U-¹³C]-葡萄糖来源的脂肪酸。（E）细胞计数分析re-WT+WT和re-Mut+Mut的U87细胞的增殖能力。（F）将1×10⁵的U87细胞与（A）中的re-WT+WT和re-Mut+Mut注射到裸鼠的脑中来建立颅内移植瘤模型，一个月后MRI扫描分析颅内成瘤情况（n＝6）。

通讯作者简介

王占祥教授

厦门大学附属第一医院

. 厦门大学附属第一医院院长，医学博士、主任医师、教授、博士生导师

. “中国医师奖”获得者，国务院特殊津贴专家

. 从事临床医学研究与疾病救治工作近40年，曾留学日本，多次到美国哈佛大学、英国牛津大学等国际知名学术机构进行交流访问，先后获得福建省优秀归国人员，福建省突出贡献中青年专家，福建省优秀共产党员，入选福建省新世纪百千万人才工程；厦门市重点引进留学归国人才，厦门市杰出科技人才，厦门市领军人才，首届厦门市医学学术与技术带头人，厦门市脑科中心学科带头人；2022年被评为厦门经济特区建设40周年创新创业人物；厦门市科学技术重大贡献奖获得者

李勤喜教授

厦门大学生命科学学院

. 厦门大学生命科学学院副院长、教授、博士生导师

. 厦门大学细胞应激生物学国家重点实验室“信号转导与肿瘤代谢”课题组组长

. 多年来主要从事肿瘤的细胞生物学及分子生物学研究；近年来在Nature Cell Biology、Molecular Cell、Nature Communications、Cell Reports、Cancer Research、Oncogene等国际主流期刊发表多篇论文，被他人引用近2000次；主持国家自然科学基金联合项目2项，国家自然科学基金面上项目5项，国家自然科学基金重大研究计划培育项目1项等多个项目，在细胞代谢和肿瘤代谢领域积淀了丰厚的科研成果

赵文涛

厦门大学附属第一医院

. 厦门大学附属第一医院细胞治疗研究中心、助理研究员

. 从事“癌基因异常激活或表达与肿瘤代谢”研究；主持中国博士后基金1项，参与国家自然科学基金促进海峡两岸科技合作联合基金项目、国家自然科学基金重大研究计划培育项目、国家自然科学基金面上项目；以第一作者/共同第一作者在eLife、Journal of Molecular Cell Biology、Cell Death &Disease、Cell Death Discovery、Journal of Biological Chemistry等杂志发表多篇研究性论文，同时以参与作者在CNS子刊Molecular Cell、Nature Communications、Cell Reports及其他杂志发表论文累积十余篇

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