外泌体是天然携带生物分子货物的内源性纳米尺寸囊泡。许多研究表明，外泌体内容物，特别是微小RNA（miRNA），通过靶向参与凋亡、炎症、自噬和氧化应激的几种信号通路而具有生物活性。外泌体含量可以以健康或病理方式影响细胞功能。此外，由于外泌体反映了亲代细胞的特征，它们的货物为疾病的早期诊断和治疗干预提供了机会。近期，在《Journal of Nanobiotechnology》期刊发表了题为《Exosomes as therapeutic and drug delivery vehicle for neurodegenerative diseases》的综述。这篇综述强调了外泌体在缓解NDs中的作用，并讨论了相关的信号通路和分子机制。此外，还讨论了外泌体的独特生物学特征，使其成为一种有前途的天然转运蛋白，用于向大脑递送各种药物以对抗几种ND。

外泌体的组成和结构

外泌体的结构涉及包封中央水性核心的脂质双层。它们的两亲性使它们能够同化亲水性和亲脂性分子，使它们在药物管理中具有价值。外泌体具有异质性组成，其根据其来源和生理状态而变化。如图1所示，外泌体富含特定的脂质、蛋白质、酶和遗传物质，这些脂质、蛋白质、酶和遗传物质参与细胞间相互作用并将信号分子转运到附近和远处。各种脂质衍生物，如鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、胆固醇和神经酰胺通常存在于外泌体膜中。分析外泌体组成揭示了常见蛋白质的存在，如四跨蛋白、细胞骨架元件、溶酶体蛋白、酶、膜转运和融合蛋白（GTP酶、膜联蛋白和flotillin）、抗原呈递分子（主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类）和细胞间粘附分子（ICAM-1）。

图1.外泌体结构和组成的化学呈现。

外泌体包括热休克蛋白(HSP)，如HSP70和HSP90，有助于展示抗原。此外，外泌体含有一组丰富的称为四跨蛋白的蛋白质。这些跨膜蛋白可以与各种配偶体相互作用，如MHC分子和整合素，表明它们显著参与形成复杂的分子结构。

外泌体富含特异性蛋白质，如ALIX和TSG101，其通过转运所需的内体分选复合物(ESCRT)对外泌体的生物发生至关重要。此外，还发现包括CD63、CD9、CD37、CD81和CD82在内的四跨蛋白参与ESCRT非依赖性途径。这些蛋白质通常被称为典型的外泌体标志物，在其他囊泡组中明显不存在。

此外，除了通常存在于外泌体中的蛋白质之外，外泌体中的某些蛋白质是特定细胞来源独有的。例如，来源于肠上皮细胞的外泌体具有不同的蛋白质，如突触融合蛋白3、C26和A33，它们依赖于上皮膜的顶端或基底外侧分泌。此外，细胞特异性外泌体的其他实例包括表达P选择素的网织红细胞和血小板上的α 4 β 1。

此外，RNA测序技术已经显示外泌体转运不同范围的遗传物质，如DNA、mRNA和各种类型的非编码RNA，如环状RNA(circRNA)、miRNA和长非编码RNA(lncRNA)。lncRNAs有助于控制细胞分化和调节细胞周期，而circRNAs被认为是miRNAs的抑制剂，与它们竞争调节基因表达。

结果2.外泌体的潜在治疗作用

外泌体可以将蛋白质和RNA转运到受体细胞。这些货物可以触发或抑制涉及炎症过程、凋亡、自噬和氧化应激的各种信号通路。因此，外泌体可能有助于多种疾病的缓解或进展。

自噬涉及回收细胞质中不必要和功能失调部分的途径。自噬体的形成是这一过程的一个重要方面。目前的研究表明，外泌体和自噬途径之间存在联系（图2），这可以影响心血管、肝脏和肾脏疾病等疾病。外泌体对自噬的影响可以通过两种机制发生：货物直接转移到细胞质中，以及与存在于细胞质膜上的特定受体如表皮生长因子受体（EGFR）和TLR1/2/4/6的相互作用。

图2.外泌体和外泌体衍生的miRNA可以连接参与自噬的几种信号通路。

大量研究已经广泛证明了TLR2/6配体在触发自噬中的作用。因此，来源于感染结核分枝杆菌的中性粒细胞的外泌体含有诱导巨噬细胞自噬的TLR2/6配体。这种机制显著有助于消除结核分枝杆菌。自噬通过激活几种细胞信号通路，包括PI3K/AKT/mTOR、RAS/MAPK和JAK/STAT，由EGFR诱导调节。人支气管上皮细胞中自噬标记物（特别是LC3II）水平升高表明外泌体miR-7-5p引起的自噬增强。这种增强是通过将注意力引向EGFR/Akt/mTOR信号通路来实现的。此外，MSC分泌的外泌体通过抑制p53/Bnip3信号通路证明了改善心脏功能和逆转缺血诱导的自噬的能力。作者提出，这些外泌体中miR-125b-5p的存在有助于其治疗益处。

多项研究表明，PI3K/AKT、MAPK和AMPK途径在自噬激活中至关重要，mTOR是这一过程的抑制剂。来源于MSCs的外泌体已经证明了通过抑制细胞凋亡和增强自噬来改善心脏修复的能力。自噬的激活与AMPK/mTOR和AKT/mTOR途径有关。另一项研究显示，从MSC获得的外泌体通过破坏mTOR信号通路显著影响自噬标志物（如LC3-II和Beclin-1）的浓度。这种破坏最终导致糖尿病肾损伤的减轻。此外，ADSCs-外泌体中的miR-486通过阻断足细胞的Smad1/mTOR信号通路激活自噬。这一发现为治疗糖尿病肾病提供了一种潜在的有希望的方法。

多项研究显示了STAT3在抑制自噬中的关键重要性。在STAT3的下游，Bcl-2与Beclin1相互作用调节自噬。已经发现含有miR-181-5p的外泌体的存在通过抑制STAT3/Bcl-2/Beclin1途径促进肝纤维化中的自噬，导致肝纤维化减少。

细胞凋亡在几种疾病进展中的作用及其随之而来的有害影响已被广泛认可。包封在外泌体内的miRNA对凋亡减弱的显著贡献已被广泛记录(图3)。由人脐带MSC制备的外泌体能够阻止细胞凋亡并抑制LC3B-II/I和beclin1在H9C2细胞中的表达。发现PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活是基本机制。外泌体miRNAs通过在脂多糖（LPS）存在下抑制炎症和减少凋亡来防止肠损伤。发现牛奶外泌体对TLR4/NF-κ B和p53途径的抑制作用与其减少炎症和防止细胞死亡的能力有关。此外，发现外泌体miR-21通过下调程序性细胞死亡4（PDCD4），在心肌细胞H9C2中面对氧化应激诱导的细胞死亡时具有抗凋亡作用。PDCD4被认为促进肿瘤细胞死亡和抑制肿瘤转移。此外，研究表明，磷酸化p38通过激活参与凋亡的关键蛋白在诱导细胞死亡中起关键作用。发现源自MSCs的外泌体是miR-21的载体，并通过抑制p38 MAPK信号传导减轻β细胞缺氧引起的细胞死亡。

图3.受外泌体和外泌体衍生的miRNAs影响的凋亡的主要信号通路。

Zhang等人发现外泌体miRNAs，特别是miR-152-3p和let-7i-5p，有效阻止了H9C2细胞缺氧刺激的凋亡。他们观察到miR-152-3p阻碍了Atg12的表达，Atg12是一种参与内在凋亡的蛋白质，通过降低Bcl-2家族中抗凋亡成员的活性来调节凋亡。此外，let-7i-5p降低了Fasl水平，Fasl是一种编码肿瘤坏死因子家族Fas配体（Fasl）的基因，通过参与死亡受体途径参与外源性凋亡途径。

外泌体miR-144下调磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）的表达可以抑制PI3K/AKT信号通路，增强PI3K/AKT蛋白的表达，导致缺氧条件下心肌细胞凋亡的抑制。类似地，从源自MSC的外泌体中分离的miR-223通过抑制PTEN，启动PI3K/AKT途径，显示出对神经元的抗凋亡作用。此外，观察到外泌体miR-106a-3p附着于CASP9，阻碍了人血管平滑肌细胞中与caspase信号传导相关的途径，表明其有望作为动脉粥样硬化治疗的治疗干预。此外，已经证实来源于诱导多能干细胞的外泌体通过抑制细胞凋亡来增强缺血性心肌细胞的存活并保护它们免受氧化损伤。外泌体的有益作用可能是由于两种重要的miRNAs的存在，特别是miR-21和miR-210。

多项研究表明，外泌体调节炎症微环境中的免疫细胞、细胞因子和炎症介质（图4）。M1和M2是巨噬细胞的两个主要分类。M1巨噬细胞通过分泌促炎因子在炎性病症的形成中发挥作用。相反，M2巨噬细胞刺激抗炎因子的释放，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子β（TGF-β）、C-C基序趋化因子配体1（CCL1）和CCL17。一项研究表明，来自MSCs的外泌体携带miR-182，可以阻碍TLR4/NF-κ B途径并增强PI3K/AKT途径，导致心脏缺血/再灌注（I/R）损伤中M2巨噬细胞的极化加速。类似地，来源于人胎盘MSC的外泌体已被证明通过靶向TLR4相关的NF-κ B/MAPK和PI3K信号通路来抑制RAW264.7巨噬细胞系中的炎症。发现从羊水(AF)产生的MSC获得的外泌体miRNAs，包括miR-146a-5p和miR-548e-5p，在暴露于LPS期间抑制与NF-κ B途径连接的蛋白质，即TRAF6。此外，AF-MSCs-外泌体有助于减少由LPS触发的丝裂原活化蛋白激酶成分（JNK、ERK1/2和P38）的活化。这些发现表明，外泌体miR-146a-5p和miR-548e-5p有望作为治疗干预来解决过度炎症诱导的早产。从IL-1b引发的MSCs中分离的外泌体缓解了骨关节炎SW982细胞的炎症。miR-147b在MSC-IL-外泌体中的表达高于MSC-外泌体，因此显示出对促炎因子表达的抑制结果高于MSC-外泌体。此外，MSCs-IL-Exo增加了抗炎元素（SOCS3和SOCS6）的水平。

图4：受外泌体和外泌体衍生的miRNAs影响的调节炎症和氧化应激的许多治疗靶点。

氧化应激是指以氧化还原稳态破坏为特征的病症。这种现象改变了身体对炎症、自噬和程序性细胞死亡的反应，它还在核酸、蛋白质和脂质的氧化中发挥作用。Nrf2又称核因子红系2相关因子2，在维持细胞氧化还原平衡中起着至关重要的作用。在存在氧化应激的情况下，Nrf2易位到细胞核。它启动一系列反应，激活抗氧化酶，如NAD（P）H醌氧化还原酶1（NQO1）和血红素加氧酶1（HO-1），以调节细胞氧化应激。引人注目的研究表明，外泌体可以通过转移miRNA和抗氧化酶mRNA或蛋白质来消除靶细胞中的氧化损伤（图4）。

根据最近的一份报告，研究人员在模拟早期卵巢功能不全的实验小鼠模型中发现外泌体miR-320a抑制SIRT4及其相关蛋白（ANT2、AMPK和L-OPA1）。这种抑制功能对于防止活性氧（ROS）204的产生至关重要。多项研究表明，PI3K/Akt/eNOS途径可降低氧化应激。研究表明，miR-132-3p通过激活缺氧/复氧（H/R）损伤的微血管内皮细胞中的Ras/PI3K/Akt/eNOS信号通路来增强MSC-外泌体的作用。在另一项研究中，MSC衍生的外泌体含有具有显著抗氧化作用的抗氧化剂miRNA，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶等酶的功能增加所证明的。在模拟癫痫发作引发的损伤的临床前模型中，它们减少了ROS的产生，并减少了对DNA、脂质和蛋白质的损伤。MSC外泌体的这些抗氧化特性被认为是通过Nrf2信号通路促进的。

已经观察到从脂肪衍生干细胞（ADSCs）获得的外泌体阻碍ROS产生并降低由LPS诱导的细胞因子水平，提供针对脓毒症的保护作用。这些有益作用与Keap1表达降低一致，Keap1表达是Nrf2的抑制剂。还发现从脐带间充质干细胞获得的外泌体通过减轻NOX1和NOX4并促进血管生成来促进糖尿病伤口愈合。Nrf2/NQO-1途径可以被人脐带中MSCs的外泌体激活，以改善非酒精性脂肪性肝炎。

总体而言，外泌体通过靶向参与自噬、凋亡、氧化损伤和炎症的多种信号通路，对各种疾病具有显著的治疗潜力。尽管它们的有希望的作用已经在细胞培养系统中得到证实，但需要进一步的体内研究来证实它们的治疗应用。

结果3. 外泌体作为有前途的脑药物载体

众所周知，血脑屏障在有效控制潜在有害物质从血液流向大脑方面发挥着至关重要的作用。这种生理屏障阻碍了各种组分到达大脑的运动，并给当前的药物递送方法带来了多种困难。BBB是由几个神经血管单位组成的复杂结构，如脑毛细血管内皮细胞（BCECs）、周细胞、基底层、星形胶质细胞、小胶质细胞和神经细胞。由于内皮紧密连接的存在，脑和非脑毛细血管的内皮之间存在结构差异（图5）。血脑屏障影响大的亲水性分子。它允许亲脂性小分子或氢键少于9个的分子以及二氧化碳和氧气等气体通过。科学家们设计了不同的纳米载体来克服血脑屏障，并将药物靶向大脑内的特定位置。然而，这些纳米制剂有两个显著的障碍：毒性和网状内皮系统对药物的快速消除。

图5.受外泌体和外泌体衍生的miRNAs影响的调节炎症和氧化应激的许多治疗靶点。

与合成替代物（如脂质体和聚合物纳米颗粒）相比，外泌体具有独特的优势。这些优点包括生物相容性、稳定性、延长血液循环、低免疫原性和低内在毒性。此外，由于其膜上丰富的蛋白质和脂质，外泌体表现出被特定靶细胞摄取的高能力。值得注意的是，即使没有表面修饰，外泌体也可以穿越或绕过生物屏障，如BBB。

与来自其他细胞的外泌体相比，某些细胞衍生的外泌体，如来自MSCs、神经元、巨噬细胞和内皮细胞的外泌体，特别能透过血脑屏障。虽然已经确定外泌体可以穿越血脑屏障，但涉及的具体分子机制仍然未知。

外泌体靶向特定细胞的能力受其携带的内容物和受体细胞的生理状况的影响。在存在神经炎症或神经损伤的情况下，外泌体可以进入大脑。具体来说，已经观察到源自MSCs的外泌体在受炎症影响的大脑区域积累，并被神经胶质细胞而不是神经元细胞吸收。这意味着外泌体可用于对脑相关疾病的精确药物递送。在一项研究调查中，从巨噬细胞中分离的未修饰的外泌体（含有脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白）显示出有效的BBB渗透。在存在神经炎症的情况下，这种递送进一步增强了3.6倍。

可以使用不同的方法实现治疗剂向脑的非侵入性递送，包括受体介导的转胞作用(RMT)和吸附介导的转胞作用。在这些方法中，RMT作为用于递送药物穿过BBB的内皮细胞的最广泛研究和使用的方法脱颖而出。它还可用于将表面修饰的外泌体运输到大脑的不同区域。使用与RMT相互作用的特定配体，如转铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体和胰岛素受体，通过RMT介导的机制引发血脑屏障穿越是可行的。T7是一种转铁蛋白受体结合肽，可以提高外泌体作为AMO-21（一种靶向miR-21的反义miRNA寡核苷酸）的智能载体的有效性。与使用未修饰的外泌体相比，这种表面修饰在减轻胶质母细胞瘤大鼠模型方面显示出改善的结果。

由于嗜神经病毒穿透脑组织的能力，广泛的研究集中在嗜神经病毒上，表明病毒或其成分作为转运蛋白将治疗物质递送到脑的潜在用途。一个实例包括利用从狂犬病病毒(RVG)的糖蛋白获得的肽，其已经显示出靶向脑和穿过BBB的前景。为了进一步增强这种方法，Yu及其同事修饰了外泌体，使其在表面呈递RVG肽，特异性靶向a7-nAChR，一种存在于大脑中的受体。这些修饰的外泌体还含有选择性降解淀粉样蛋白-β(A β)的脑啡肽溶素变体，淀粉样蛋白-β是AD发展中的关键成分。配制的外泌体成功到达并定位在大脑的海马区域内，有效降低A β 40水平并缓解炎症。

总的来说，外泌体有望作为解决脑疾病的先进纳米载体，这要归功于它们绕过血脑屏障的固有能力、有利的物理特征以及修饰其表面的能力。尽管外泌体具有理想的物理特征，但仍然需要多种生物技术策略和工程化方法来增强靶标识别，促进BBB的有效遍历，并实现适当的生物分布。需要更广泛的研究来推进成像技术，以跟踪外泌体向大脑的转运，并增强我们对它们穿过血脑屏障的理解。

结果4.外泌体和外泌体递送货物在不同类型NDs中的作用

缺血性中风

当流向大脑特定区域的血流突然中断，导致神经功能受损时，就会发生急性缺血性中风。这种情况通常是由于大脑血管堵塞而发生的，这可能是由于血凝块（血栓形成）或从身体另一部分形成的血凝块（栓塞）。在血管阻塞期间，大脑经历一个发生不可修复损伤的中心区域和一个称为半影的周围区域，在半影中，大脑功能因血流量减少而受损，但尚未受到不可逆损伤。

Pei及其同事利用超速离心方法获得了星形胶质细胞来源的外泌体（ASExo）。这些AS-Exo外泌体已经显示出改善神经元存活和减少由氧和葡萄糖剥夺（OGD）触发的凋亡的能力。此外，体内实验证明了AS-Exo外泌体通过调节自噬对神经元损伤的有益作用。2020年，研究人员发现，当直接施用到脑室时，来自脑内皮细胞的外泌体增加了大鼠选定大脑区域的BrdU/巢蛋白阳性细胞。巢蛋白是神经上皮干细胞特有的蛋白质，是细胞骨架中间丝家族的一部分。这种蛋白质在调节干细胞功能中至关重要。这一发现突出了外泌体在急性缺血性损伤期间再生神经元血管结构和保护大脑的潜力。

另外的研究发现，脑内皮外泌体可以增强经历大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）和相关损伤的小鼠的特定脑区域的运动功能并增加血流量。此外，已经观察到这些外泌体支持突触调节蛋白的表达，同时防止脑细胞死亡。值得注意的是，已经观察到运动活动、空间记忆、神经元活动和接受MCAO的大鼠中枢神经系统（CNS）内外泌体浓度之间的关联。

在经历MCAO的大鼠脑中，NF-κ B、TNF-α、IL-6、iNOS和COX2等炎症相关基因增加。然而，引入来源于表达肿瘤易感基因101(TSG101)的神经干细胞(NSC)的外泌体导致上述酶的表达显著降低。先前的研究表明，参与信号转导的TSG101和衔接子分子在外泌体的产生和释放中具有关键作用。早期的研究表明，过表达TSG101会显著增加外泌体的分泌。

在中风中，多种细胞机制，包括细胞迁移、增殖、分化、凋亡、血管形成和氧化应激，受到PI3K/AKT途径调节的严重影响。体外OGD实验结果证明了外泌体对保护OGD暴露大鼠的初级皮质神经元的显著积极影响。这项研究表明，观察到的保护作用可归因于BDNF水平的增加和PTEN/AKT途径的调节。如前所述，BDNF已显示出通过各种机制治疗CNS病症(包括中风)的有效性，并且其具有修复脑损伤的显著潜力。此外，据报道，将BDNF与其他中风治疗策略相结合是有益的。

当与BDNF组合时，可以进行细胞内研究来研究外泌体对中风的影响。在检查I/R损伤的研究中，使用了来源于过表达BDNF的人胚胎肾细胞的外泌体。BDNF-外泌体疗法通过减少氧化应激和钙离子丢失来预防H/R引起的细胞凋亡。它还维持了暴露于I/R的受损SY-5Y细胞线粒体膜电位的稳定性。

Zhu等人的另一项研究表明，当暴露于H2O2时，来源于掺入BDNF的NSCs的外泌体显著降低了BAX的水平并切割了caspase 3，表明细胞凋亡减少。此外，工程外泌体表现出促进神经干细胞转化为神经元的活性。

在缺血性损伤期间通常观察到ROS的过量存在，特别是在缺血性中风的情况下。缓解该问题的一个潜在解决方案是利用依达拉奉(EDV)，一种有效的自由基清除剂。在小鼠中通过静脉注射施用外泌体和EDV已经揭示了对中风早期阶段的神经功能的积极影响。这归因于通过转铁蛋白与其相应受体的相互作用实现的脑特异性靶向机制。此外，含有EDV的外泌体在永久性MCAO模型中表现出神经保护特性，并促进小胶质细胞极化从M1到M2的转变。

外泌体介导的药物递送允许神经保护药物跨血脑屏障转运，使其成为NDs的合适药物载体。Huang及其同事证明，在小鼠的短暂性MCAO和pMCAO模型中，与单独的黄芩苷相比，负载在外泌体中的黄芩苷（外黄芩苷）表现出增加的溶解度和增强的脑靶向性。此外，外黄芩苷有效抑制ROS的产生并激活Nrf2/HO-1途径。与单独的外泌体或Cur相比，来源于胚胎干细胞并负载姜黄素（Cur）的外泌体提供了额外的益处。这些优势源于外泌体的抗炎特性和Cur的抗氧化作用的结合。Cur-外泌体通过抑制脑部病变中ROS的积累和减少与线粒体相关的凋亡，在减轻I/R损伤方面显示出有希望的治疗作用。此外，Cur-外泌体比单独的Cur表现出更高的溶解度、稳定性和生物利用度。槲皮素（Que）被掺入表面修饰的外泌体中，并与针对生长相关蛋白43（GAP43）的单克隆抗体缀合，以靶向受损的神经元并提高它们的存活。这种结合增加了受损脑区中Que的积累，并允许通过靶向Nrf2/HO-1途径阻断ROS的产生。

烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的表达增加被广泛认为可显著改善由缺血引起的脑损伤。来自星形胶质细胞的外泌体可以修复OGD/R引起的神经元损伤并促进神经元自噬。这些外泌体分泌的Nampt通过干扰AMPK/mTOR途径增强了自噬并抑制了凋亡

最近的证据表明，色素上皮衍生因子（PEDF）具有神经保护和抗炎特性。已经发现含有PEDF的外泌体通过促进自噬和防止凋亡来减轻I/R引起的损伤。此外，越来越多的证据表明Zeb2/Axin2在神经发生中的作用有助于中风后的功能恢复。递送Zeb2/Axin2的外泌体已被证明可以增强中风后的神经可塑性，增加神经发生，并提高BDNF的浓度。

外泌体在跨血脑屏障膜转移miRNA中具有关键功能。使用外泌体miRNA缓解CNS疾病有两种不同的策略。一种方法包括使用含有miRNAs的外泌体，而另一种方法包括将外源性miRNAs掺入阻碍疾病介导的基因或强化神经保护因子的外泌体。

MCAO后，miR-210（一种微小RNA）的浓度最初在损伤部位升高。然而，在MCAO后的第一小时至24小时内，miR-210浓度显著降低。在这一关键时期，载有miR-210的RGD（Arg-Gly-Asp）-外泌体增强了miR-210的表达，导致血管生成因子水平增加，动物存活率提高。

通过BMSC-外泌体转移miR-21-5p减轻缺血性脑损伤并加速血管生成。这种作用通过血管内皮生长因子（VEGF）、VEGF受体2（VEGFR2）、血管生成素-1（Ang-1）和具有免疫球蛋白样和EGF样结构域2的酪氨酸激酶（Tie-2）表达水平的上调得到证实。MiR-22-3p存在于来源于脂肪来源的MSC（ADMSC）的外泌体中，通过调节BMF/BMP2轴，抑制KDM6B的作用来减轻缺血性脑损伤。研究表明，BMF水平升高会加速神经元死亡，KDM6B通过BMP2上调BMF导致缺血性损伤。

尿来源的干细胞外泌体增强了缺血性中风后大鼠的神经元生成并减少了神经损伤，并且用暴露于OGD/R的神经干细胞进行的体外实验显示，外泌体刺激了神经元的生长和分化，可能是通过转移外泌体miR-26a来抑制组蛋白脱乙酰酶6（HDAC6）的表达。这些发现表明，外泌体有可能成为治疗脑缺血的有效治疗策略。在2021年进行的一项研究中，体外试验表明，源自脐带间充质细胞的外泌体（hUMSC-Exo）减少了OGD后小胶质细胞的炎症。体内研究显示，在用含有miR-146a-5a的外泌体治疗的小鼠中，梗死面积显著减小，行为异常逆转，所述外泌体通过IRAK1/TRAF6途径阻断炎症反应而发挥作用。该途径还降低了小胶质细胞的促炎作用。

已经发现向大鼠施用褪黑激素触发血浆外泌体的产生，在血流量减少的情况下表现出针对炎症和由炎症小体引起的细胞死亡的保护作用。褪黑激素处理的外泌体的施用已证明通过调节tolllike受体4(TLR4)/NF-κ B信号传导途径减少了组织损伤并增强了功能恢复。此外，褪黑激素给药引发了外泌体微小RNA谱的变化，确定了在神经功能恢复中起作用的特定miRNA和相关途径。

研究表明，小胶质细胞在各种神经疾病中起着至关重要和多样的作用，导致长期的神经元损伤。值得注意的是，已经观察到小胶质细胞的M2表型激活防止炎症诱导的神经元死亡的保护机制。研究表明，来源于M2表型小胶质细胞的外泌体miR-137可以通过靶向Notch1信号通路来抑制神经元死亡，Notch1信号通路与缺血诱导的损伤有关。泛素特异性蛋白酶14（USP14）已被鉴定为缺血性中风导致的脑损伤的关键贡献者。然而，最近的研究表明，含有miR-124的M2小胶质细胞释放的外泌体可以逆转中风的有害影响，并促进神经元存活。这些研究发现提供了证据，证明外泌体miR-124精确地将其注意力导向并抑制USP14。

来源于骨髓中携带长非编码RNA ZFAS1的MSCs的外泌体（BMSCs-Exo）增加了缺血性卒中中SOD的水平，减少了凋亡，并抑制了炎症。发现这种作用是由于ZFAS1对microRNA-15a-5p的抑制作用。早期生长反应2（Egr2）调节促炎细胞因子并减轻缺血性中风的影响。BMSCs衍生的外泌体可以通过转移Egr2和刺激sirtuin（SIRT）6的表达，抑制Notch信号传导来逆转MCAO/R引起的脑损伤。

众所周知，circRNAs在调节自噬中起作用。含有circSHOC2的外泌体具有神经保护作用，并通过激活自噬减少OGD引起的神经元凋亡。这是通过抑制miR-7670-3p的活性来实现的，这导致SIRT1的表达增加并阻止凋亡。因此，circSHOC2/miR-7670-3p/SIRT1途径显示出作为缓解缺血性中风的靶点的前景。Yang等人揭示了携带circ-Rps5的外泌体改善了急性缺血性卒中，改善了认知缺陷，并触发了向M2小胶质细胞的转变。还观察到miR-124-3的上调和SIRT7的下调抵消了circ-Rps5对M2小胶质细胞极化的影响。

来自星形胶质细胞的外泌体含有抑制TLR7途径的microRNA34c。这抑制了NF-κ B/MAPK信号通路，减少了炎症，减轻了I/R损伤引起的神经损伤。在另一项研究中，从ADSCs转移miR-30d-5p获得的外泌体对脑损伤具有神经保护作用。这些外泌体还减少炎症，逆转与自噬相关的M1小胶质细胞极化表型，并增强M2小胶质细胞极化。此外，外泌体miR30d-5p可以通过靶向Beclin-1和Atg5的3’UTR显著抑制Beclin-1和Atg5的表达。在患有急性缺血性中风的个体中，血浆中miR-126的浓度降低。然而，外泌体的静脉给药促进了中风后miR-126的转移，导致功能恢复改善、神经发生促进、小胶质细胞激活抑制和神经炎症减少。

设计了用携带抗miR-181a寡核苷酸的RAGE结合肽修饰的外泌体。向模拟MCAO的啮齿动物模型鼻内施用这些外泌体抑制TNF-α表达，增强Bcl-2表达，并减小梗死面积。此外，靶向外泌体比未修饰的外泌体或裸外泌体更有效地递送抗miR-181a寡核苷酸。已经发现外泌体通过miR-17-92的转移在增强中风恢复和促进轴突-髓鞘重组中具有关键作用。这种转移机制导致PTEN的抑制，最终刺激PI3K/Akt/mTOR途径。

总之，外泌体在缓解缺血性中风方面显示出有希望的治疗效果。需要进一步的体内研究来阐明外泌体缓解缺血性卒中的确切机制。此外，可以应用化学或遗传修饰外泌体表面的工程策略来实现靶向递送。

多发性硬化（MS）

MS是一种神经系统疾病，由免疫系统攻击神经纤维周围的保护性髓鞘定义，可导致显著损伤。这种损伤会影响神经系统的各个部分，导致生理、认知和偶尔的心理并发症。症状可能因受影响的神经和神经损伤的程度而异。在Wu等人进行的研究中，从小鼠的NSC中提取外泌体，并用慢病毒武装的PDGFR配体修饰以产生靶向外泌体。这些靶向外泌体用于递送苔藓抑素-1，其增强髓鞘的保护功能并促进髓鞘再生。此外，它抑制星形胶质细胞增生、轴突损伤和促炎小胶质细胞的激活。小胶质细胞对监测中枢神经系统具有至关重要的影响，其M1/M2表型的不平衡有助于MS的发展。

在涉及动物刺激MS的临床前模型中，研究人员使用巨噬细胞衍生的外泌体作为将白藜芦醇转运至中枢神经系统的内源性载体。这种创新方法有效地减少了中枢和外周神经系统的炎症。MS的发展涉及激活一系列细胞因子，包括TNF-α和IL-12，它们在引发炎症反应和对髓鞘（神经纤维的保护性覆盖物）造成损害中起作用。相反，已知IL-10和TGF-β是控制这种疾病的可能治疗选择。已经发现，BMSCs释放的外泌体可以增强反映神经行为的评分，减少CNS中炎性细胞的侵袭，并减轻脱髓鞘。此外，该研究记录了施用外泌体后M2相关细胞因子（IL-10和TGF-β）的增加以及M1相关细胞因子（TNF-α和IL-12）的减少。此外，通过静脉内递送从IFN γ刺激的MSCs获得的外泌体导致脱髓鞘和神经炎症的减少，同时还促进了EAE小鼠脊髓中调节性T细胞（Tregs）的数量。

适体是小RNA和DNA分子，具有二级或三级结构，使它们能够选择性地结合细胞内的蛋白质或其他靶标。如文献所示，LJM-3064适体由于其对髓鞘的强亲和力而被广泛研究并用作靶向配体和疗法。一项体内研究观察到，当在暴露于特定病原体之前施用附着于外泌体的LJM-3064适体时，Th1反应被抑制，而Treg群体增加。应进行靶向外泌体的生物分布以确定体内外泌体的命运。用RVG肽工程化的外泌体显示出靶向大脑的倾向，为中枢神经系统疾病的药物递送和疗效提供了潜在的改善。为了进一步改善BDNF向大脑的转运，Zhai等人开发了负载BDNF mRNA并用RVG肽修饰的外泌体。然后将这些修饰的外泌体通过鼻途径给药于cuprizone小鼠，证明了高效递送BDNF、促进髓鞘再生和改善运动协调的潜力。总体而言，外泌体作为治疗和天然载体可以对抗MS，这是一种通过几种机制减弱MS的有前途的疗法。

阿尔茨海默病（AD）

AD的特征是特定脑区A β斑块和过度磷酸化Tau的积累，导致突触缺陷和神经元损失。降解清除系统涉及在分解细胞外A β中至关重要的几种蛋白酶。尽管目前没有治疗AD的方法，但已经探索了几种治疗方法。为了解决这些问题，一项研究调查了一种新的AD治疗策略。该方法涉及使用负载水飞蓟宾（一种类黄酮化合物）的巨噬细胞衍生的外泌体。该方法旨在预防患有AD的小鼠的β聚集并增强认知能力。

用Exo-Slb(负载水飞蓟宾的外泌体)处理抑制星形胶质细胞刺激并减少各种细胞因子的释放，包括TNF-α、IL-6和IL-1 β。此外，该处理抑制了NF-κ B途径，导致A β处理的SH-SY5Y细胞的凋亡阻断。天然存在的类黄酮化合物Que已经证明了通过保护大脑、减少氧化应激和减少炎症来增强认知功能的潜力。它可能有助于减轻Tau病理，减缓淀粉样斑块的形成，并诱导自噬。

在一项涉及患有冈田酸（OA）诱导的AD的小鼠的研究中，施用Que负载的血浆外泌体（Exo-Que）增强了Que的神经保护作用。这是通过抑制CDK5实现的，CDK5是一种参与Tau蛋白非典型磷酸化的蛋白质。通过抑制CDK5活性，Exo-Que成功地减少了不溶性神经原纤维缠结（NFT）的发展，这是AD的一个特征。此外，Exo-Que通过减少与细胞死亡相关的蛋白胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3显示出增强的抗凋亡作用。

Cur-primed外泌体增强了患有OA诱导的认知障碍的小鼠的认知能力。这种改善归因于AKT/GSK-3途径对Tau蛋白过度磷酸化的抑制和细胞凋亡的减少。当来源于LFA-1的外泌体与内皮ICAM-1相互作用穿过血脑屏障时，检测到海马中Exo-Cur的存在显著增加。

CoQ10是一种膳食补充剂，具有抗炎和抗氧化应激作用。当Exo和CoQ10一起给药时，它们增强了链脲佐菌素诱导的AD的认知功能。这种改善是通过增加海马中BDNF和性别决定区Y盒2(SOX2)的水平实现的。

一项研究发现，当BMSC-外泌体通过侧脑室引入时，它们表现出有效性，而通过尾静脉注射则没有产生相同的结果。这种干预导致AD样行为的显著改善，小胶质细胞激活和脑炎症的抑制，淀粉样蛋白积累的减少，神经细胞的恢复，以及BDNF表达的增加。Chen及其同事进行的一项研究发现，MSC外泌体为AD患者提供了治疗益处。这些外泌体可以分解A β斑块，改善大脑葡萄糖代谢和认知能力，并调节表观遗传学和基因表达。这种潜在的治疗特别有希望，因为它可以在没有完整细胞的情况下施用。通过下调HDAC4表达，MSC-外泌体促进靶基因的恢复。在源自沃顿氏果冻MSCs(WJ-MSCs)的MSC-外泌体中，miR-29a是最普遍的miRNA。这种特定的miRNA靶向HDAC4，这是一种在组蛋白修饰中至关重要的酶，在大脑中大量存在。HDAC4在维持体内平衡和调节与突触可塑性、神经元存活和神经元发育相关的基因方面至关重要。值得注意的是，患有AD的个体表现出显著升高的核HDAC4水平。此外，在AD小鼠模型中，HDAC4的总水平（细胞质和细胞核）升高。

采用基因工程技术进一步增强外泌体的治疗特性，并产生表面上具有RVG肽的修饰的外泌体组合物。这种修饰使得能够选择性靶向a7-nAChR，导致有效降解A β的neprilysin变体的富集水平。研究中使用的外泌体来源于源自脂肪组织的干细胞。此外，RVGEXO制剂是专门针对大脑海马体而设计的。施用该制剂证明IL1a、TNF α和NF-κ B的表达降低，同时IL10的表达增加。将EXO-RVG与CD10dm组合进一步改善了治疗功效并减少了N2a细胞内A β 40的存在。最终目的是开发一种精确而有效的外泌体组合物来有效地控制AD。

一项单独的研究表明，用CNS特异性肽RVG修饰源自MSCs的外泌体增强了APP/PS1转基因小鼠的认知能力。MSC-Exo和RVG之间的连接通过DOPE-NHS接头实现。静脉内施用MSC-RVG-Exo导致斑块沉积和A β浓度的显著降低以及星形胶质细胞活化的显著降低。这种给药还导致炎性细胞因子浓度显著降低。

另一项研究证明了在AD小鼠模型中利用源自ADMSC的负载miR-22的外泌体通过控制gasdermin D(GSDMD)来预防上睑下垂的发作和随后的炎性介质的释放的功效。Exo-miR-22抑制焦亡，一种依赖于炎性天冬氨酸酶的程序性凋亡形式。这种抑制与CD206和IBA-1的存在减少有关，这表明Exo-miR-22抑制小胶质细胞活化。此外，Exo-miR-22抑制GSDMD和p30-GSDMD的表达，并降低NLRP3和胱天蛋白酶-1的表达。引入增强环境（EE）有效地防止了AD小鼠模型中的认知损伤。这是通过多种机制实现的，包括减少星形胶质细胞的炎症、增加突触连接和刺激海马下垫区的CP细胞。此外，EE的实施已显示提高血流中Th1衍生的INF-γ的浓度，这可能影响脉络丛细胞释放神经营养因子。这些位于脑丛中的细胞已被鉴定为释放到CSF中的miR-146a外泌体的来源。

因此，结果表明外泌体可能是一种有希望的天然药物，通过其货物影响几种信号通路来改善AD。此外，需要更深入的临床前研究来解释外泌体在AD中的确切机制，并为AD的临床治疗带来希望。

帕金森病（PD）

PD被认为是全球第二大最普遍的神经退行性疾病，影响1%至4%的60岁以上个体。帕金森病的主要临床表现包括运动迟缓、肌肉僵硬、震颤和难以保持平衡。这种情况的特点是多个大脑区域缺乏多巴胺能神经元和称为路易体（LB）的细胞内结构。这些区域还表现出神经炎症和α-syn基因突变和复制簇，这显著有助于PD的发展。

在各种研究中，学者们广泛探索了人工创造的DNA适体对α-syn积累的影响，α-syn是一种与PD相关的蛋白质。异常α-syn的积累导致氧化应激增加和线粒体功能障碍，最终导致多巴胺能神经元变性。在一项研究中，研究人员发现，将RVG附着到外泌体的外部可以实现特定的神经元靶向和适体的成功递送。这种递送方法显著减少了由α-syn预制原纤维(PFF)引起的异常聚集的产生，从而减少了PD小鼠模型中的神经行为缺陷。使用外泌体的另一种有效且安全的递送方法涉及反义寡核苷酸(ASO4序列)以下调α-syn聚集。exo-ASO4还减少了PD小鼠模型中多巴胺能神经元的退化，减轻了α-syn表达，并增强了运动性能。

PD的一种潜在治疗方法涉及使用多巴胺，但其有效性受到BBB的限制，这阻碍了其进入大脑。为了克服这一挑战，多巴胺可以被截留在纳米颗粒中，从而实现更好的BBB渗透。然而，这种方法仍然存在一些挑战，研究人员需要探索在大脑中分配多巴胺的替代方法。

在一项研究中，研究人员使用饱和溶液孵育技术将多巴胺封装在血液外泌体中。有趣的是，这些外泌体证明了通过转铁蛋白-转铁蛋白受体相互作用穿过BBB的能力，显著改善了包括纹状体和黑质在内的大脑中的多巴胺分布超过15倍。此外，当在PD小鼠模型中静脉内施用时，多巴胺包封的外泌体显示出比游离多巴胺更低的毒性和更高的治疗功效。多巴胺包裹的外泌体增加了多巴胺能神经发生，增强了内源性多巴胺、酪氨酸羟化酶和抗氧化酶，随后改善了PD小鼠模型中的神经行为功能。

儿茶素在临床前研究中显示出潜在的神经保护作用。在儿茶素中，最突出的是表儿茶素没食子酸酯（ECG），它具有显著的神经保护特性。ECG已被证明保护SHSY5Y细胞免受H2O2诱导的损伤。然而，由于稳定性和生物利用度方面的问题，其实际应用目前受到限制。为了克服这一挑战，外泌体在不同的生物机制中具有关键功能并保留药物的治疗功效，通过提高大脑递送和分布效率提供了一种有前途的解决方案。据报道，PINK1/parkin通路调节线粒体自噬。最近的一项研究表明，ECG-Exo有可能通过干扰PINK1/parkin通路来保护SHSY5Y细胞免受氧化应激和神经毒性，从而抑制有丝分裂。值得注意的是，还发现ECG-Exo通过阻碍胱天蛋白酶3和增加Bcl-2/BAX比率来减少细胞凋亡。为了进一步增强治疗潜力，科学家们开发了一种混合纳米颗粒，该纳米颗粒由gene-chemo核心（Cur/苯硼酸-聚（2-（二甲氨基）丙烯酸乙酯）纳米颗粒）和修饰的外壳部分组成，该外壳部分具有靶向SNCA的小RNA分子，并用RVG-外泌体修饰。这种创新的纳米复合物充当纳米清除剂，有效减少α-syn聚集并显著改善PD小鼠模型中的运动性能。

PD的特征在于神经递质调节、脂质和能量代谢以及线粒体功能障碍的破坏，所有这些都可以显著影响CNS。对从血清和脑组织获得的外泌体的深入分析揭示了PD小鼠和对照小鼠之间代谢物表达的显著差异。在PD动物模型中，用血液外泌体治疗在减少神经系统炎症和凋亡方面显示出有希望的结果。此外，外泌体疗法改善了运动协调性，促进了丢失的多巴胺能神经元的恢复。因此，外泌体可以作为PD的治疗干预和诊断工具。

来源于MSCs的外泌体已被鉴定为通过刺激ICAM1-SMAD3/P38MAPK信号通路来缓解MPP+诱导的PD症状并促进人脑微血管内皮细胞（HBMECs）的生长。应该提到的是，开发生物分布方法来寻找外泌体在动物体内的命运是一个迫切的需求。类似地，来自正常星形胶质细胞的外泌体已经证明了在SH-SY5Y细胞和原代中脑多巴胺能神经元培养物中防止凋亡的能力，这要归功于miR-200a-3p的存在，其抑制MKK4蛋白和mRNA的表达。发现炎症小体/上睑下垂和自噬的调节分别涉及NAcht亮氨酸重复蛋白3（NALP3）和CDK5。引入携带miR-188-3p的外泌体已经证明了通过靶向NLRP3来阻碍上睑下垂的能力。此外，富含miR-188-3p的外泌体抑制CDK5介导的自噬，并降低自噬相关因子的水平，包括LC3-II/I和p62。众所周知，氧化还原酶（如过氧化氢酶和SOD）浓度降低与氧化应激和神经变性密切相关。在外泌体中包含过氧化氢酶（一种有效的抗氧化剂）有助于其在大脑中的积累，从而产生神经保护和炎症的减少。关于治疗干预，使用外来装置递送外泌体过氧化氢酶mRNA已经证明了在细胞和PD小鼠模型中降低神经毒性的能力。

PD以α-syn聚集体的积累为标志，使得α-syn的减少成为有希望的治疗靶点。虽然siRNA疗法仅在短期内有效，但使用shRNA修饰的巨噬细胞(shRNA-MCs)提供了持久的效果。已经发现将抗α-syn shRNA-MC掺入用RVG修饰的外泌体中可抑制α-syn聚集并抵消多巴胺能神经元的缺陷。

最近的报道表明，Wnt信号通路的破坏在推进PD和其他ND中具有功能。据观察，在多巴胺能神经元的分化过程中，外泌体含有高水平的Wnt5a，其在保护多巴胺能神经的同时有效减少黑质的炎症。此外，通过外泌体转移Wnt5已被证明通过增强过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPAR γ）的功能来恢复PD模型中的昼夜节律紊乱。

在另一项研究中，从BMSC中分离的外泌体可以缓解PD模型中的认知障碍，并通过靶向Wnt5a-受体相关蛋白1（LRP1）信号轴来改变神经元胆固醇的失调代谢。

简而言之，外泌体可以是递送药物的有前途的工具，为延长药物可用性和药物释放、PD的微创管理提供了巨大的潜力。考虑到缺乏将药物运输到大脑的替代有效方法，对预防和治疗神经疾病的新方法的需求不断增加。外泌体为有效和有规律地将药物递送到大脑提供了独特的机会，确立了它们作为缓解几种类型NDs的关键工具的重要性（图6）。

图6：外泌体在不同类型NDs中的治疗潜力

小 结

外泌体是在生理和病理生理条件下由不同生物流体中几乎每个细胞释放的纳米脂质双层。外泌体具有几个惊人的特性，使其成为治疗NDs的合适药物递送系统。各种研究已经评估了外泌体在几种神经退行性疾病如AD、PD、MS、中风和SCI中的治疗潜力。这些结果突出了外泌体通过促进神经发生、阻碍神经炎症、促进血管发生和增强突触可塑性而参与缓解这些病症。虽然外泌体为神经退行性治疗提供了几种独特的特性，但仍然需要外泌体的表面修饰来增加靶向递送、绕过BBB并实现适当的生物分布。此外，由于外泌体在各种生物体液中传递NDs错误折叠蛋白，它们可以为NDs的早期诊断、预后和早期治疗干预提供机会。许多研究表明，外泌体有望用于NDs的早期检测和治疗，但仍存在一些未解决的问题。这些问题中的一些包括：(1)改进用于增加外泌体靶向递送的工程化方法，工程化外泌体的表面蛋白允许细胞和组织靶向特异性。通过外泌体靶向递送神经保护剂提高了靶细胞中治疗剂的浓度并减少了潜在的副作用。（2）开发用于跟踪外泌体的生物分布方法。外泌体成像新技术的进步提供了外泌体分布的更准确描述，增强了我们对外泌体在正常和病理条件下参与的理解，并创建了一种基于外泌体的治疗方法，该方法被批准用于临床。（3）寻找外泌体的确切血脑屏障穿越机制。值得注意的是，外泌体可以通过血脑屏障并控制其生理功能。然而，外泌体调节血脑屏障的确切分子机制仍未完全了解。（4）外泌体在动物模型中的有益作用和多重作用机制评价。需要进一步的体内研究来完全阐明外泌体在各种ND中的关键益处和机制。

Zeinab Nouri,, Ashkan Barfar, Sahra Perseh, Hamidreza Motasadizadeh8, Samane Maghsoudian, Yousef Fatahi, Keyvan Nouril, Mohaddese Pourashory Yektakasmaei, Rassoul Dinarvand,Fatemeh Atyabi. Exosomes as therapeutic and drug delivery vehicle for neurodegenerative diseases Nouri et al. Journal of Nanobiotechnology (2024) 22:463.