德国癌症研究中心的Niklas Grassl等首次将H3K27M疫苗注射给8例进展性H3K27M弥漫性中线胶质瘤患者并证实有效，结果在线发表在2023年9月的《Nat Med》上。

——摘自文章章节

该研究纳入2017年8月至2022年11月在海德堡大学曼海姆医院接种H3K27M疫苗的患者。纳入标准为组织学证实H3K27M⁺DMG。允许同时进行PD-1单抗治疗，所有患者之前均接受放疗和替莫唑胺化疗。排除标准：①地塞米松（或等效）＞4mg/d；②Karnofsky绩效指标（Karnofsky performance index，KPI）＜70；③年龄＜18岁。磁共振每12±2周进行，每次接种疫苗及此后每12周评估不良反应。H3K27M疫苗由德国蒂宾根大学合成，皮下注射到患者腹部或大腿，注射部位尽可能靠近之前注射部位，注射目标是相同淋巴结引流。影像伪进展定义为T2-FLAIR MRI序列中肿瘤增大然后稳定或缩小。所有统计分析都在R语言版本3.6.1中进行。

在标准治疗方案后，共有8位患者组织学证实为H3K27M⁺DMG而且不符合目前正在进行的多中心I期临床试验（NCT04808245）的入组条件，在同情性用药途径接受了H3K27M疫苗。4名女性，4名男性，年龄为28.0±5.3岁， KPI至少70%。接种疫苗前在神经肿瘤治疗反应评估标准下，所有患者评定为明确的进行性疾病。肿瘤3例位于丘脑，2例位于脑桥，2例位于脊髓，1例位于顶叶，其中一例在小脑和腰髓有多发病灶。2例完全切除，3例部分切除，3例活检。第一次给药时，2例服用地塞米松（2mg），1例（4mg）。所有患者均已接受30次放疗，总剂量为54-60Gy，并接受替莫唑胺化疗。1例接受洛莫司汀治疗，并在接种疫苗后继续治疗。中位肿瘤大小为407.8±589.4 mm²。患者接受H3K27M疫苗皮下注射，每两周一次，持续6周，然后每月一次，持续4月，然后每季度给药一次。5例接受H3K27M疫苗联合抗PD-1，每次接种疫苗前，根据不良事件通用标准对不良事件进行评估。此外治疗计划包括每月抽血进行免疫监测，为期6个月，此后每3个月抽血一次，以及每3个月影像评估一次。如果有临床指征则进行脑脊液分析。H3K27M疫苗治疗的持续时间为78-1295天（中位数158天）。

自H3K27M疫苗给药开始，观察持续时间为191至1414天（中位数391天）。患者接受了8±4.9次疫苗接种。一名患者在接种了八次疫苗后停止H3K27M疫苗接种，但20个月后恢复治疗。两名患者经历了1级注射部位反应，归因于H3K27M疫苗。观察期内的其他8例1级事件被判断为与治疗相关，但与H3K27M疫苗无关，没有发生更高级别的治疗相关毒性。5例观察到H3K27M疫苗诱导的外周T细胞免疫应答，首次检测到H3K27M特异性免疫反应为2次疫苗注射（四分位数范围2-4），时间为治疗开始后4周（四分位数范围4-10）。4例有反应患者中，外周血中检测到特异性ELISpot反应。H3K27M特异性外周免疫反应与年龄（P=0.60）、性别（P=0.46）、KPI（P=0.75）、切除程度（P=0.94）、肿瘤大小（P=0.08）、组织学诊断到开始接种疫苗时间（P=0.06）、伴PD-1单抗治疗（P=0.57）、地塞米松（P=0.15）之间没有明显相关。6例观察到短暂的放射学改善，其中5例为首次检测到H3K27M特异性免疫反应后不久发生（图1a，b）。所有患者开始接种疫苗后的中位无进展生存期（progression free survival, PFS）为6.2月，OS为12.8月（图1b、c）。在首次检测到突变特异性外周免疫反应后6周内，1例（ID1）接种H3K27M疫苗但未同时进行PD-1单抗治疗的患者显示出影像伪进展（图1a，d）。另一例（ID8）同时行PD-1单抗治疗显示早期放射学进展，随后疾病稳定（图1e）。福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织蛋白质邻近连接分析技术（Proximity ligation assay，PLA）表明，H3K27M新表位与HLA II-DR类共定位于7名患者肿瘤细胞和髓细胞，采用4,6-联脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,2-（4-amidinophenyl）-1H–indole，DAPI）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）和离子化钙结合适配分子（ionized calcium-binding adaptor molecule 1，IBA1）共染色（图2a–c），结果表明H3K27M疫苗刺激下出现H3K27M新表位和H3K27M特异性肿瘤浸润HLA DR限制性T细胞。免疫组化结果显示，MHC Ⅱ表达的个体差异很明显，阳性细胞数为22%至85%，两名患者（ID1和ID8）在检测到H3K27M特异性外周免疫反应后疗效显著（图2d，e）。在H3突变肽或野生肽刺激下外周CD4⁺和CD8⁺T细胞结果表明，H3K27M特异性免疫反应是CD4+T细胞介导的，可以由MHC II类抗体抑制，但不能被MHC I类抗体抑制（图3a-e）。肽刺激下外周血单核细胞细胞因子染色证实存在H3K27M特异性CD4⁺T细胞反应，没有证据表明存在H3K27M疫苗诱导的CD25+FoxP3+调节T细胞（图3f-j）。患者（ID1）影像伪进展后，脑脊液中检测到前十个疫苗诱导H3K27M扩展CD4⁺T细胞受体（T cell receptor,TCR），显示这10个TCR的CDR3β区序列相似性，随后该患者31月后肿瘤完全缓解（图3k，l）。

图1. H3K27M疫苗的临床反应。a.肿瘤大小与疫苗接种开始时间的函数。b.PFS与疫苗接种开始时间的函数。c.OS与疫苗接种开始时间的函数。d.患者（ID1）在开始、第10周和第34周的T1增强序列。白色箭头表示在第10周出现影像伪进展。e.患者（ID 8）的T1增强序列，开始和第12周之间有早期进展，随后疾病稳定，同时在第18周外周血中首次检测到H3K27M特异性免疫反应。

图2. H3K27M新表位与HLA II-DR抗体共定位于肿瘤细胞和髓细胞。a.患者（ID1）和（ID8）原发性肿瘤组织的PLA与H3K27M和HLA-DR抗体（红色）DAPI核染色为蓝色。b. GFAP染色为绿色。c. IBA1染色为绿色。独立重复两次，结果相似。比例尺为白色（30μm）和灰色（10μm）。d.在7例有福尔马林固定石蜡包埋组织样本的患者中，每个视野的PLA斑点与HLA-DR表达的免疫组织化学评分进行Pearson相关性分析。采用双侧t检验。e.滚球算法去除背景、高斯滤波快速算法和最大值检测后进行自动分割。比例尺为白色（30μm）。

图3. H3K27M特异性免疫应答是CD4⁺T细胞介导的。a.通过抗MHC II类抗体抑制H3K27M特异性干扰素-γELISpot应答，而不是通过抗MHC I类抗体，与基线相比自疫苗接种以来18周（P=0.002；P=0.008，自上而下）和22周（P=0.001；P=0.006，自上而下）差异明显。双侧t检验，不针对多重比较进行调整。点表示单个数据点，条形图显示平均值，误差条形图表示标准差，**表示p<0.01，***表示p<0.001。b-e.通过流式细胞仪检测H3K27M肽扩增外周血单个核细胞IFN-γ和TNF-α，在用H3野生肽（b，d）或H3突变肽（c，e）刺激下的CD4⁺（b，c）和CD8⁺（d，e）T细胞亚群。f.体外和扩增后胞内细胞因子染色证实H3突变肽和H3野生肽刺激下表达TNF-α的T细胞在所有CD4⁺T细胞中百分比。ELISpot应答用柱状图表达。g-j. H3K27M反应性TNF-α+CD4⁺T细胞（橙色）与H3K27M无反应性CD4⁺T细胞（灰色），不包含CD25+FoxP3+调节性T细胞。描述了来自患者（ID1）18周（g）和118周（h）以及患者（ID8）0周（i）和18周（j）的体外胞内细胞因子染色数据。k.在患者（ID1）不同时间点，十个H3K27M扩增最丰富的CD4⁺T细胞占原发组织、脑脊液和外周血中所有T细胞的比例。i.去除重复出现的CAS序列后，k中10个TCRs的CDR3β区序列相似性的模式图。在脑脊液中检测到的TCR3、TCR4和TCR6的CDR3β与基序的重叠由颜色和下划线表示。

该研究结果表明，①使用长肽（如27个氨基酸的H3K27M疫苗）无论是否同时行PD-1单抗治疗都是安全的，并且能在H3K27M⁺DMG患者体内诱导与突变相关的CD4⁺T细胞反应。②H3K27M疫苗和IDH1疫苗都靶向肿瘤细胞蛋白质的克隆驱动突变，并且这些突变对肿瘤生长很重要。③H3K27M疫苗诱导的T细胞克隆在外周血和脑脊液中均被检测到，并与影像上肿瘤回缩同时扩增。将H3K27M疫苗用于新诊断的H3K27M⁺DMG患者，并与标准一线治疗同时进行，可以使CD4⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫提供治疗效益最大化。