Hu, L., Shi, J., Shen, D. et al. Osimertinib induces paraptosis and TRIP13 confers resistance in glioblastoma cells. Cell Death Discov. 9, 333 (2023). https://doi.org/10.1038/s41420-023-01632-6

背　景

脑胶质瘤是起源于脑神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，2021年版WHO中枢神经系统肿瘤分类将胶质瘤分成1-4级，其中胶质母细胞瘤（GBM）属于恶性程度最高的4级胶质瘤，一年生存率10%，五年生存率不足5%，中位生存期15-18个月。而在原发性GBM中最常见的分子生物学改变为表皮生长因子受体（EGFR）的扩增、过表达及突变，因此靶向EGFR已然成为了GBM的潜在治疗策略。

奥希替尼（Osimertinib），是一种第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI），在临床试验及临床应用中已证明对肺癌等多种癌症具有显著疗效^[1]。然而已批准的第一代和第二代EGFR-TKIs，如厄洛替尼，对改善GBM患者预后并无太大作用，部分原因在于其穿透血脑屏障（BBB）能力较差，而奥希替尼则表现出较强的血脑屏障穿透能力，并在临床前和临床试验中显示出对GBM细胞的抑制作用，从而为EGFR驱动的GBM的临床治疗提供了巨大的潜力。

结　果

Osimertinib显著抑制了GBM细胞（LN-18、LN-229、SF-539和U87MG）的细胞活力、克隆形成、3D成球能力，并将GBM细胞的细胞周期阻滞在G2/M期（图1A-D）；暴露于Osimertinib的GBM细胞中Cyclin D1蛋白水平呈剂量和时间依赖性减少（图1E、F）。同时，Osimertinib显著降低了细胞中EGFR下游两个主要的信号：AKT和ERK1/2的活化（图1G）。此外，Osimertinib显著减缓了异种移植小鼠脑肿瘤生长速度（图1H），佐证了体外实验结果。

用不同浓度的Osimertinib处理GBM细胞不同时间，观察到Caspase-3和PARP这两种凋亡标志物的剪切水平没有显著的变化（图2A、B），我们在过表达EGFRvIII的GBM细胞中也得到了类似的结果。此外，Osimertinib处理GBM细胞也没有显著改变典型的自噬标志物LC3II和p62的表达水平。凋亡抑制剂z-VAD-FMK、自噬抑制剂BafA1也均未回复奥希替尼诱导的细胞死亡，以上结论证实了Osimertinib引起的GBM细胞死亡与凋亡或自噬无关。

随后，我们对Osimertinib处理的GBM细胞进行了细胞形态学观察，发现细胞质空泡呈时间依赖性积累，而细胞膜和细胞核基本保持完整（图2C）。为了研究细胞质中空泡的来源，对Osimertinib处理的LN-229细胞进行了电镜分析，发现了线粒体肿胀和内质网结构扩张（图2D），这种结构改变正是副凋亡的典型特征。

Osimertinib处理后，细胞中蛋白泛素化水平显著增加（图2F），CHX预处理可逆转Osimertinib引起的泛素化。进一步的研究表明，胞质空泡化主要来自内质网应激。错误折叠和未折叠蛋白的积累可能导致内质网应激的增加，Osimertinib上调了内质网应激的几个关键蛋白水平，包括CHOP、GRP78/BiP和ATF4（图2H）。此外，Osimertinib也上调了GBM细胞球中CHOP的蛋白水平，而无论是BafA1还是z-VAD-FMK都不能显著阻止Osimertinib诱导的细胞泛素化水平以及CHOP、BiP的上调（图2G、J）。因此，Osimertinib诱导的GBM细胞死亡具有副凋亡的形态学和生物学特征。

通过转录组测序比较Osimertinib和对照处理细胞的基因表达谱，结果显示上调的差异表达基因显著富集在未折叠蛋白反应（UPR）、IRE1α激活伴侣基因以及XBP1(s)激活伴侣基因相关的通路（图3A）。同时检测了内质网应激途径的两个主要参与者（PERK）-eIF2α和IRE1α的活性，用靶向PERK（ISRIB）或eIF2α（Salubrinal）的化合物进行预处理，显著减弱了Osimertinib诱导的CHOP表达、多泛素化蛋白的积累、细胞空泡化以及细胞死亡（图3B、C、E）。然而，用IRE1α抑制剂4μ8C进行预处理却未能逆转上述现象。此外，GBM细胞中敲低CHOP不会改变Osimertinib诱导的多泛素化蛋白水平的增加，表明Osimertinib阻断了CHOP上游的蛋白酶体活性，且在此过程中，内质网应激途径中的PERK-eIF2α轴发挥着关键作用（图3D）。

通过整合多基因组数据集，在EGFR-TKIs耐药的六种潜在调节因子（CDK6、GBP1、TRIP13、ERBB3、NTN4、MYH14）中确定了唯一的EGFR结合蛋白TRIP13（图4A）。此外，我们的前期研究发现TRIP13通过增强EGFR信号传导以促进GBM进展。因此，TRIP13可能为Osimertinib在GBM中的潜在的耐药基因。与对照组相比，过表达TRIP13的GBM细胞对Osimertinib表现出显著的耐药性，Osimertinib诱导的CHOP蛋白表达上调以及ERK1/2磷酸化水平下调都可以被过表达TRIP13所逆转，而敲低中现象相反（图4B-E）。形态学结果显示，过表达TRIP13减少了Osimertinib诱导的细胞质空泡的形成，而敲低TRIP13增加了细胞质中空泡的形成（图4F、G），以上结果表明TRIP13可能会干扰Osimertinib诱导的GBM细胞副凋亡，并赋予Osimertinib耐药性。

基于以上发现，我们在细胞水平上试图筛选出GBM中EGFR-TKI耐药的潜在调节因子，发现只有AKT抑制剂MK-2206能够显著降低GBM细胞中的TRIP13水平（图5A-C）。在Osimertinib处理的细胞中，MK-2206能够拮抗过表达TRIP13诱导的CHOP下调和细胞空泡化（图5D、E）。同时，MK-2206与Osimertinib能够协同抑制过表达TRIP13细胞的生长（图5F）。

在裸鼠原位成瘤模型中，与单独使用任一药物相比，MK-2206和Osimertinib联用能够更有效地抑制肿瘤生长，并显著延长生存期（图5G、H）。免疫组化结果显示，与单独用药组相比，MK-2206和Osimertinib联用的小鼠肿瘤切片中的Ki67和TRIP13染色显著减少（图5I）。

参考文献

通讯作者简介

朴浩哲 教授

辽宁省肿瘤医院

辽宁省肿瘤医院党委书记，神经外科主任，二级教授

大连理工大学、中国医科大学、大连医科大学、辽宁中医药大学博士研究生导师

中国抗癌协会副理事长、中国抗癌协会第六届神经肿瘤专业委员会主任委员

担任辽宁省胶质瘤重点实验室主任，沈阳市神经胶质瘤临床医学研究中心主任

现主持国家科技部重点研发项目、国家自然联合基金重点支持项目、国家自然科学基金面上项目、辽宁省卫健委重大科研项目等多项课题，研究经费近1850余万元。在国内外医学期刊上发表科研论文63余篇，SCI收录43篇，合计影响因子（IF）近190分

研究成果获“中国抗癌协会科技奖”二等奖、辽宁省科学技术进步奖一等奖、辽宁省科学技术研究成果奖。现已培养博士、硕士研究生33人，其中博士后2人，博士14人

作为主编、副主编出版《神经系统恶性肿瘤》、《整合肿瘤学》、《常见恶性肿瘤诊疗规范》、《肿瘤细胞免疫治疗及基因检测实验技术图解》等专著

从事神经外科工作35年，始终致力于神经系统肿瘤的诊疗工作。朴浩哲教授在脑胶质瘤、脑转移癌及淋巴瘤等中枢神经系统恶性肿瘤诊疗方面具有丰富经验，于国内率先提出针对颅脑恶性肿瘤诊疗的多学科协作模式（MDT）的理念，使颅脑恶性肿瘤患者能够获得个体化综合诊疗方案。朴浩哲教授尤其擅长经鼻蝶入路神经内镜下颅底及鞍区病变切除术，开展了东北地区第一例神经内镜下垂体瘤手术。近年来开展了脑干肿瘤、三脑室、四脑室肿瘤及巨大颅底肿瘤等一系列高难度外科手术