星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的特化神经胶质细胞类型；它们协助神经元维持大脑稳态。然而，在神经炎症条件下星形胶质细胞变得“反应性”并导致中枢神经系统炎症和神经元损失。神经毒性反应性星形胶质细胞由小神经胶质细胞释放的TNF-α、Il-1α和补体成分1q（C1q）诱导。在阿尔茨海默病(AD)、帕金森病和多发性硬化症(MS)患者的脑组织样本中检测到神经毒性反应性星形胶质细胞。这些发现表明神经毒性反应性星形胶质细胞在多种神经系统疾病的发病机制中发挥重要作用。因此，阻断神经毒性星形胶质细胞转化已被证明有助于预防或挽救在肌萎缩侧索硬化症(ALS)小鼠、帕金森病和AD模型中观察到的神经变性。迄今为止，可以通过抑制小胶质细胞活性或消耗小胶质细胞细胞因子水平来抑制反应性星形胶质细胞的产生。然而，尚未确定或开发出调节神经毒性反应性星形胶质细胞的直接靶点或治疗方法。

    已知的CNS炎症关键调节因子是异二聚体转录因子(TF)核因子(NF)-κB，NF-κB通路的激活与各种神经退行性疾病相关，包括AD。在中枢神经系统特异性NF-κBα抑制剂(IkBα)条件敲除(KO)小鼠中，NF-κB通路上调，其中一种反应性星形胶质细胞标记物-补体C3过度表达，这表明NF-κB的作用反应性神经毒性星形胶质细胞或功能中的κB信号传导。此外，星形胶质细胞NF-κB通路失活可导致表达IkBα显性失活形式的星形胶质细胞特异性转基因小鼠脊髓损伤后的功能改善。这些数据表明星形胶质细胞中NF-κB的信号级联在AD等神经退行性疾病的发病机制中发挥作用。鉴于异常NF-κB激活在神经炎症性疾病中的重要性，阐明星形胶质细胞NF-κB通路如何加剧疾病进展非常重要。

    为了阐明Nrf2在星形胶质细胞中的作用，作者建立了原代星形胶质细胞培养物，并在体外检查了Nrf2途径在神经毒性反应性星形胶质细胞标记基因表达中的作用（图2A）。Il-1α/TNF-α/C1q（炎症）刺激诱导了先前鉴定的神经毒性反应性星形胶质细胞标记基因C3、H2-D1、Serping1和Iigp1的表达（图2B）。Nrf2稳定剂，例如萝卜硫素(SLF)、马来酸二乙酯(DEM)和15-脱氧-12,14-前列腺素J2(Δ15-PGJ2)，它们与Nrf2束缚蛋白KEAP1上的巯基(-SH)基团反应并启用Nrf2为了逃避不断的蛋白酶体降解，抑制了神经毒性反应性星形胶质细胞标记基因的诱导（图2B）。作者证实，星形胶质细胞中C3染色的强度在炎症治疗后上调，而SLF治疗则抑制了这种强度（图2C）。因此，Nrf2蛋白的稳定可以抑制反应性星形胶质细胞标志物的表达。

    为了进一步明确Nrf2特异性参与反应性星形胶质细胞标记基因的表达，作者制备了Nrf2KO小鼠的原代星形胶质细胞，并评估了神经毒性反应性星形胶质细胞标记基因的表达。作者发现，炎症刺激会诱导H2-D1、Serping1和Iigp1的表达。在Nrf2 KO星形胶质细胞中，炎症刺激会加剧H2-D1、Serping1和Iigp1的表达（图2D），表明Nrf2参与了神经毒性反应性星形胶质细胞标记基因的表达。反应性星形胶质细胞标记基因C3、Gbp2和Qa1（H2-T23基因的产物）的表达上调。(H2-T23基因的产物）的表达也在蛋白质水平上得到了证实（图2E);因此，这些数据证实Nrf2调节神经毒性反应星形胶质细胞标记基因的表达。

    为了从星形胶质细胞培养物中排除小胶质细胞，作者通过阻止诱导多能干细胞（iPSCs）向小胶质细胞的中胚层来分化星形胶质细胞（图2F）。作者发现，反应性星形胶质细胞标记基因C3和HLA-A（对应小鼠H2-D1基因）的表达在神经炎症刺激下上调，而在Nrf2诱导剂存在的情况下，这些由人类iPSCs生成的星形胶质细胞的表达下调（图2F）。因此，作者的数据表明，在小鼠和人类星形胶质细胞中，Nrf2诱导调节了神经炎症刺激引起的神经毒性反应性星形胶质细胞标志物的基因表达。

    接下来，作者研究了Nrf2对NF-κB的影响，因为已确定的反应性星形胶质细胞诱导细胞因子Il-1α和TNFα共同驱动NF-κB下游通路。首先，作者利用NF-κB通路抑制剂研究了NF-κB级联是否参与神经毒性反应性星形胶质细胞标记基因的诱导。结果显示IκB激酶（IKK）抑制剂TPCA-1、Bay11-7082、BOT-46和BMS345541能抑制IKK复合物并抑制NF-κB下游通路的激活，它们能以剂量依赖性的方式阻断炎症刺激对标记基因的诱导。抑制NF-κB通路对C3蛋白的下调作用在原代星形胶质细胞培养物中也得到了证实。

    接下来，作者检测了受炎症细胞因子刺激的星形胶质细胞中Nrf2-结合增加和p65-结合减少的基因在TSS区域的表达。因此，作者在刺激过程中用星形胶质细胞的5-乙基尿嘧啶(EU)标记新转录产物进行了新生RNA测序(图A)。新生RNA图谱清楚地表明，星形胶质细胞的活性基因，如C3、H2-D1和Gbp2在刺激时被强烈转录，而这种上调的转录在与SLF共处理时被抑制。通过ChIP-seq鉴定的减少p65-与SLF结合的基因，如Gbp5、Cxcl11和Tnfaip3在炎症刺激下新生转录物也显示出强劲的上调，而这种上调被SLF共处理抑制。

值得注意的是，其他被称为“泛反应性”(Lcn2、Vim和Gfap)和“A2”(Clcf1、Ptx3和Sphk1)星形细胞亚型的基因在炎症细胞因子治疗后显示p65积累;然而与SLF共处理并没有诱导p65结合和新生RNA的显著减少。为了了解在有/没有SLF处理的炎症条件下p65结合与p65结合基因表达之间的相关性，作者计算了SLF炎症条件下新生转录本每千碱基外显子每百万读取数(RPKM)的“新生RNA比率”与DMSO条件下的“新生RNA比率”。然后用p65的ChIP-seq获得的数据计算出的“p65结合比率”绘制新生RNA比率。为了关注SLF处理下的下调基因，作者根据RNA比例提取了前五个百分位的基因(图4B，红色表示下调基因)。作者观察到，在SLF处理后转录量减少的前五个百分位数的基因在p65-结合比率图的y轴上分布在零以下，这表明在SLF炎症条件下p65-结合减少。这一发现表明，基因表达的减少与p65-结合的减少有关。作者使用p65/Nrf2结合比率图(图3D)突出了这五个百分位数的基因，以进一步证实它们的表达与p65-结合之间的相关性。这两个种群是分开分布的;SLF.炎症条件下转录量较少的基因的5个百分点(用红色标记)表现出Nrf2结合增加和p65结合减少(图4C)，这表明SLF.炎症条件下Nrf2结合增加的基因的p65结合峰数量减少，新转录的群体较小(用红色标记)。为了阐明p65/Nrf2调控的途径，作者对转录量在前5%的基因进行了京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析;这些基因在病毒感染和抗原呈递途径中富集(图4D)。值得注意的是，新生基因表达的KEGG分析与Nrf2/p65 ChIP-seq中提取的基因的GO分析(图3E)非常吻合，这强烈表明Nrf2/p65在神经炎症条件下调节反应性星形胶质细胞标记基因的表达。

为了在体外建立反应性星形胶质细胞模型进行ChIP-seq/新生RNA-seq分析，作者使用了炎症细胞因子，即Il-1α/TNFα/C1q，该因子先前被确定可诱导A1星形胶质细胞。然而，单细胞测序技术的最新进展表明，与二维A1/A2分类相反，星形胶质细胞有多种亚型，并且在7月龄5xFAD小鼠的海马中描述了至少6个星形胶质细胞转录组簇。为了更深入地了解作者研究中确定的NF-κB/Nrf2调控的反应性星形胶质细胞基因，特别是“疾病相关星形胶质细胞(DAA)”，作者从第4类(GFAP-高“DAA”)中提取了基因，并与第1类和第2类(GFAP-低“稳态星形胶质细胞”)进行了比较，然后绘制了DMSO比值的数据。炎症组超过DMSO.NT。作者的分析显示，p65结合在炎症刺激下被上调，因为大多数基因分布在零以上，这意味着在炎症刺激下培养的星形胶质细胞中，DAA基因似乎受到NF-κB途径的调节。为了进一步阐明与SLF处理条件的重叠，作者将DAA基因与图3D中的图和图4B中的图合并。与Habib等人的结果一致，一些DAA基因与炎症细胞因子刺激下上调的星形胶质细胞活性基因重叠。此外，一些DAA基因似乎受到Nrf2轴的调控，237个DAA基因中有25个与SLF共处理后下调的5个百分位基因重叠。例如，Apoe的基因表达在炎症刺激下没有改变，p65在TSS位点的募集也没有被观察到。在TSS位点的CLU、Cst3和Fth1基因中观察到p65对炎症细胞因子的募集，但它们的表达水平没有上调。Chil1和Aqp4基因可能受Nrf2依赖通路的调控。因此，DAA亚型的基因受到包括NF-κB/Nrf2轴在内的各种调控。

作者注意到，下调的基因(前五个百分比)包括来自IFN-I和抗原递呈途径的基因，如Mx2(干扰素诱导的GTP结合蛋白Mx2)，IRF5(干扰素调节因子5)，eif2ak2(真核翻译起始因子2-α激酶2;编码PKR(双链RNA活化蛋白激酶)、β-2-微球蛋白(B2m)和Tap1(T转运体1)。作者观察到细胞因子刺激后TSS区域p65峰的积累，通过与SLF共处理（图4E中的绿色）减少了p65峰的积累。与这些观察结果相证实的是，这些基因的转录率在DMSO.inflamm条件下增加，但在与SLF共处理时受到抑制（图4E中的绿松石色）。与这些观察结果相证实，DMSO下这些基因的转录率增加。作者证实，这些基因的翻译产物PKR、B2M、TAP1和IRF9的表达在炎症细胞因子的炎症刺激下被诱导，并在SLF或TPCA-1处理下被抑制(图4F)。

接下来，作者研究了这些基因在诱导多能干细胞衍生的人类星形胶质细胞神经炎症条件下的诱导作用。作者发现IFN-I基因(Mx2、Ifit1和Irf7)和抗原提呈通路基因B2m的表达在炎症细胞因子刺激下上调，而与Nrf2诱导剂(SLF和DEM)或NF-κB通路抑制剂TPCA-1共处理可抑制IFN-I和抗原提呈通路相关基因的表达(图4G)。这些结果表明，在神经炎症刺激下，SLF处理可抑制人和小鼠星形胶质细胞中IFN-I和抗原提呈通路相关基因的表达。

    为了探索星形胶质细胞靶向治疗神经炎症引发的神经变性的可能性，作者检查了神经炎症引起的脑功能障碍是否可以通过增强Nrf2通路来挽救。作者给3个月大的5xFAD小鼠使用了ALGERNON2(ALG2)，这是一种Nrf2通路增强化学物质，可以稳定p21/Nrf2，并评估了10个月大的WT和5xFAD小鼠海马中反应性星形胶质细胞的转化。作者发现与WT小鼠相比，ALG2治疗降低了5xFAD小鼠海马组织中C3、Ifit1、IRF5、Tap1和B2m的表达（图5A）。作者观察到C3定位于阿米巴状小胶质细胞周围的星形胶质细胞聚集在5xFAD小鼠脑组织样本的Aβ斑块区域周围（图5B，右上）。此外，在5xFAD小鼠中使用ALG2后，C3的上调表达受到抑制（图5B，右下）。使用蛋白质印迹分析评估了用ALG2处理的5xFAD小鼠的海马组织中C3、IRF9、PKR和B2M的表达水平下调（图5C）。作者使用Fluoro‑Jade C(FJC)对神经变性进行组织化学检测和量化，FJC特异性结合受损神经元并帮助可视化受损神经元。因此，作者发现用ALG2治疗的小鼠下托中FJC点的数量减少（图5D）。因此，ALG2给药成功抑制了神经毒性反应性星形胶质细胞的转化，并挽救了5xFAD小鼠中由神经炎症引起的神经变性。

为了检查Nrf2通路的增强是否在挽救受损的认知功能中发挥核心作用，使用Morris水迷宫评估了空间学习（图5E，scheme）。5xFAD小鼠在训练期间表现出比WT小鼠更慢的学习曲线。然而，给予ALG2的小鼠在训练过程中表现出加速的学习曲线，接近WT小鼠；与未治疗的AD小鼠相比，ALG2治疗的小鼠探针测试中表现出改善的表现（图5E）。被动回避测试进一步证实了认知能力的提高，其中动物由于足部电击而学会了不进入暗室（图5F）。因此，作者的数据强烈表明，Nrf2通路的激活可以抑制反应性星形胶质细胞的基因表达和功能，并挽救5xFAD小鼠受损的脑功能。

在这项研究中，作者报道Nrf2通过抑制神经炎症刺激时p65的募集来抑制神经毒性反应性星形胶质细胞的产生，而ALG2（一种增强Nrf2轴的治疗药物）可以挽救5xFAD小鼠的认知障碍。因此，作者确定Nrf2是参与神经毒性反应性星形胶质细胞功能的关键参与者，并且是治疗神经炎症引起的神经退行性变的潜在治疗靶点（图6）。

全文链接：Nakano-Kobayashi A, Canela A, Yoshihara T, Hagiwara M. Astrocyte-targeting therapy rescues cognitive impairment caused by neuroinflammation via the Nrf2 pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Aug 15;120(33):e2303809120.

编译：钟日梅

校审：陈   风