为了具体研究横断面I中显著的CD8⁺T细胞结果的再现性和稳健性，我们分析了一个更大的研究群体，称为横断面II。与横断面I相比，参与者的选择对β-淀粉样蛋白的要求不那么严格，也包括更接近临界值的值。由于更新了标记物面板，我们能够通过tSNE和FlowSOM聚类进行更详细的聚类表征和鉴定，鉴定出七个主要亚群（图3A和3B）。我们比较了诊断组中CD8⁺T细胞簇的相对丰度中位数。基于10%的错误发现率，我们发现与HCS β-淀粉样蛋白-相比，HCS β-淀粉样蛋白+受试者的CD8⁺幼稚T细胞显著减少，CD8⁺TERA/Effector细胞增加（图3C）。诊断组之间的年龄差异对相对聚类丰度的影响很小（图S2D，Spearman相关性：−0.5<rho<0.5）。尽管横截面II中的男性/女性分布不平衡（图1D，表S2），但研究参与者的性别对感兴趣的免疫细胞簇没有影响（Pearson’s卡方检验：p（CD8⁺幼稚T细胞）=0.50；p（CD8⁺TERA/Effector细胞）＝1.00）。额外的多元线性回归分析再次证实，CD8⁺T细胞簇的丰度在很大程度上与年龄和性别无关；只有幼稚的CD8⁺T细胞受到年龄的显著影响，尽管估计值接近0（图S2E）。我们发现，与非携带者相比，APOE ε4携带者中的CD8⁺TERA/Effector细胞升高（图3D）。此外，APOEε4基因型是一个混淆变量，因为我们在APOE ε4携带者中观察到显著更高的β-淀粉样蛋白负荷中位数（图3E）。

我们使用相关的CITRUS聚类证实了我们的发现。用CITRUS为来自90个随机选择的样本的CD8⁺T细胞生成的分层聚类图显示了具有不同丰度的细胞簇（图3F）。与HCS β-淀粉样蛋白-相比，HCS β-淀粉样蛋白+和MCI β-淀粉状蛋白+受试者的CD8⁺幼稚T细胞和CD8⁺ CD57⁺TEMRA/Effector细胞均发生显著变化（图3G）。

因此，我们在第二项独立分析中证实，早期大脑β淀粉样变性（HCS β-淀粉样蛋白+）的临床前AD阶段伴有外周T细胞区室的改变。重要的是，在横断面II中，也在“AD引起的MCI”阶段（MCI β-淀粉样蛋白+）中，可以观察到上述免疫变化。由于横截面II的MCI β-淀粉样蛋白+组的中位β-淀粉状蛋白负荷低于横截面I的HCS β-淀粉类蛋白+组（图S1I），因此这些受试者的β淀粉样蛋白病理程度较低，与横截面I中的HCS β-淀粉样蛋白+阶段更具可比性。因此，在横截面II中，β-淀粉样蛋白+健康受试者和MCI受试者均可观察到T细胞改变。

图3. 横断面II–证实AD早期CD8⁺TERA/Effector细胞丰度增加

这两项横断面研究的结果都表明，早期β-淀粉样蛋白在大脑中的积聚以血液中免疫谱的改变为特征，这表明大脑β-淀粉变性与外周免疫系统之间存在联系。然而，某些诊断组可能因病毒感染的亚临床水平而存在偏见。特别是，疱疹病毒感染被认为与AD发病机制有关，并且可能是观察到的外周免疫改变的驱动因素。为了研究这一点，我们测试了我们预先确定的诊断组与针对疱疹病毒科的血清抗体滴度（如VZV、HSV-1、HSV-2、EBV和CMV）之间的可能关联。我们分别检测了IgM和IgG滴度，以确定急性感染和长期免疫（图S4A和S4B）。所有研究参与者都被证明超过了各种疱疹病毒科IgG的诊断阈值。值得注意的是，横断面I中46%的受试者和横断面II中40%的受试人的抗CMV IgG检测呈阳性，这种病毒已知会影响外周CD8⁺TERA细胞的比例。相比之下，在两个队列中仅观察到极少数IgM滴度呈阳性的病例，这表明急性感染水平较低。统计测试显示，诊断组之间的抗病毒IgG血清滴度没有显著差异，表明疱疹病毒科感染并不优先发生在特定的认知或β-淀粉样蛋白状态（图4A和4F）。

接下来，我们通过将FlowSOM衍生的亚簇的相对簇丰度与四种定量评估的疱疹病毒科（VZV、CMV、HSV-1、HSV-2）的血清抗体滴度相关联，来检查疱疹病毒科对CD8⁺T细胞亚群的特异性影响。在这两项横断面研究中，没有一个CD8⁺T细胞亚群受到针对VZV、HSV-1和HSV-2的IgG滴度增加的显著影响（图S4C和S4D，Spearman相关性：−0.5<rho<0.5）。然而，CD8⁺T细胞亚群主要在截面I中受到抗CMV IgG滴度改变的影响，而在截面II中则较少（图4B和4G）。具体而言，CD8⁺ EM T细胞与抗CMV IgG水平的升高呈负相关（rho≤−0.5），而CD8⁺TEMRA/Effector器和NK T细胞呈正相关（rho≥0.5）（图4B）。在大脑β-淀粉样蛋白组和APOE基因型中未发现抗CMV IgG滴度的差异（图S4E和S4F）。

正如预期的那样，我们观察到，与CMV受试者相比，抗CMV IgG（CMV+）检测呈阳性的个体表现出显著更高的CD8⁺TERA/Effector细胞相对丰度（图4C和H）。由于这是一个细胞群，我们将其确定为与临床前β-淀粉样变性相关的特征性标志簇，我们使用线性回归调整了感兴趣的CD8⁺T细胞簇的相对丰度，以控制CMV感染的影响。调整后的残差统计测试显示，在横截面I和II中，与HCS β-淀粉样蛋白-受试者相比，HCS β-淀粉样蛋白+受试者的抗CMV IgG滴度调整后的CD8⁺TEMRA/Effector细胞仍显著升高（图4D和I）。此外，在横截面中II、 与HCS β-淀粉样蛋白-相比，MCI β-淀粉状蛋白+患者的CD8+TERA/Effector细胞仍然增加（图4I）。CMV滴度调整后，幼稚CD8⁺T细胞的显著减少也基本保持不变（图4E和J）。

因此，我们证实，在横断面设置中，观察到的CD8⁺T细胞的免疫细胞特征簇是早期β-淀粉样变性的临床前阶段的特征，与潜在的、重新激活的或急性疱疹病毒科背景感染无关。从横截面I中未发现疱疹病毒IgG滴度与CD4⁺T细胞簇之间的显著相关性。

图4. β-淀粉样蛋白对外周适应性免疫细胞的相关作用与潜伏疱疹病毒感染无关

在确定了认知健康受试者大脑中与早期β-淀粉样蛋白沉积相关的免疫模式后，我们询问这些变化是否也与AD生物标志物随时间的积累有关。出于这个原因，我们调查了59名老年人，他们的认知能力没有受到影响，并接受了为期3年的随访。对于每个个体，我们评估了大脑β-淀粉样蛋白负荷通过基线时和3年后研究结束时的两次[11C]-PiB PET扫描，并在基线时、1.5年后（称为Follow-up1）和3年后（也称为Follow-up2）采集用于PBMC分离的血液（图5A）。在基线和随访时评估血浆AD生物标志物，如p-tau181。

我们分析了来自所有59名研究参与者的所有可用时间点的PBMC（表S3），这些参与者使用改进版本的CyTOF抗体组来表征T细胞。CyTOF采集后，数据集在tSNE/FlowSOM图中进行聚类和可视化（图5B）。每个聚类的单个标记信号强度用于识别人类PBMC的主要聚类（图5C）。由于我们有兴趣了解AD病理学，特别是大脑β淀粉样蛋白积聚和血浆p-tau181增加与外周免疫细胞特征的关系，我们将受试者分为大脑β-淀粉样蛋白或p-tau181水平随时间保持基本稳定的个体组（称为非累积者）和水平随时间增加的个体组。对于β-淀粉样蛋白分析，基于皮质PiB SUVR随时间的变化（ΔPiB SUVR=PiB SUVRFollow-up2–PiB SUVRTBaseline），我们将所有ΔPiB SUVR值≥0除以中位数，将ΔPiB SUVR≥0.04的个体归类为β-淀粉状蛋白累积物（n=24），将ΔPiB SUVR<0.04的个体分类为非β-淀粉样蛋白累积物，n=35）（图5D和E）。与非积累者（ΔPiB SUVR=0.003，IQR=0.028）相比，积累者的中值ΔPiB SU VR（ΔPiB-SUVR=0.082，IQR=0.078）明显更高（图5F）。因此，这种方法使我们能够仅识别与非积累者相比，PiB保留率随时间明显增加的积累者。ΔPiB-SUVR与基线时每个个体的年龄的相关性显示，随着时间的推移，没有很强的相关性（图S5A，rho=0.2287，p=0.0814）。正如预期的那样，APOE ε4携带者与非携带者相比，ΔPiB-SUVR的中位数更高（图5G和S5B）。在35名非累积型受试者中，2名受试者在基线时为β-淀粉样蛋白+，而在24名累积型受检者中，14名受试人在基线时呈β-淀粉状蛋白+（图S5B）。此外，我们观察到高基线PiB SUVR与随时间增加的ΔPiB SUVR之间存在显著相关性（图5H，rho=0.4275，p=0.0007）。

或者，根据血浆p-tau181水平随时间的变化（Δp-tau1181）对受试者进行分类。血浆p-tau181水平由Δp-tau181=0.13pg/mL的中位数划分，以区分p-tau11累积型和非累积型（图5I）。血浆Δp-tau181在p-tau1181累积型和APOE ε4携带者中显著更高（图5J和5K）。较高的基线p-tau181水平与Δp-tau1181的增加没有过度相关（图5L，rho=0.2489，p=0.0596）。相反，基线时的年龄与较高的血浆Δp-tau181显著相关（图S5C，rho=0.4881，p=0.0001）。

图5. AD生物标志物积累受试者的外周免疫图谱：一项纵向研究设计

CD3⁺CD4^-CD8⁺T细胞通过FlowSOM亚群化（图S6A）。在没有多重比较分析的情况下，我们增加了FlowSOM分析可能的子聚类的数量。这些变化导致21个CD8⁺T细胞亚群的鉴定（图S6B）。如前所述，所有集群根据其主要T细胞亚群进行分类。

在线性混合模型（LMM）中，我们旨在探索AD生物标志物反应变量（如“皮质β-淀粉样蛋白PET”和“血浆p-tau181水平”）如何与协变量相关，如“所考虑的每个时间点的相对细胞簇丰度”（=相对丰度）、“组”（累积与非累积）和“年龄”（公式S1）。作为读数，我们使用了一个相互作用术语来描述免疫细胞簇的相对丰度变化和分配给累积型组（=相对丰度：累积型）的综合影响。使用这个相互作用项，我们研究了个体AD生物标志物随时间的增加是否与累积物的相对细胞簇丰度的变化显著相关，或者仅与自然衰老相关（图6A）。

当关注反应变量“皮质β-淀粉样蛋白PET”时，我们发现CD8⁺T细胞簇16、17和18的相互作用项显著相关，它们都属于具有CD27^-标记表达的TEMRA/Effector细胞的亚簇类别。在CD57⁺ TERA/Effector细胞中观察到最显著的相关性（CD8⁺T细胞簇17，相对丰度：累积型p值=0.01480，图6B-6D）。与我们之前的发现一致，幼稚的CD8⁺T细胞也发现了显著的相关性（CD8⁺T淋巴细胞簇1和2，图6B-6D）。

对于反应变量“血浆p-tau181水平”，我们发现CD8⁺T细胞簇6、9和10具有显著相关性，它们都属于PD-1⁺，可能耗尽EM T细胞（图6E-6G）。这些关联与横断面I的结果一致（图2K）。簇6、9和10的进一步特征在于低CD127和高KLRG1表达。在簇9和10中检测到CD57的表达（图S6B）。

总之，纵向队列分析还证实了与AD生物标志物的积累相关的适应性免疫细胞特征，如大脑β-淀粉样蛋白沉积和血浆p-tau181水平的增加。重要的是，这些免疫变化是在AD的早期临床前阶段观察到的，当时通常还没有出现认知障碍。除两名转为MCI的患者外，大多数研究参与者的认知能力保持健康。

图6. 纵向分析表明AD生物标志物累积型中的特异性T细胞改变

我们得出的结论是，外周血T细胞区室的变化先于AD的临床诊断，与大脑β-淀粉样变性和/或血浆AD生物标志物有关，并且与潜在的病毒感染无关。未来的研究将指向具有更大队列规模和更长随访时间的验证性纵向研究。这些信息可用于进一步研究免疫细胞的变化是否可能先于已确立的AD血浆生物标志物，因为它们可以对低肽抗原浓度做出反应，而成功的血浆分析需要高于检测极限的某些肽水平。如果发现有风险的人群，早期AD相关的免疫细胞变化可能会提供指导，并促使采用更昂贵的下游分析技术。必须研究观察到的免疫细胞变化是否随着AD病理的进展而持续消失，正如在脑β-淀粉样蛋白负荷最高的MCI β-淀粉状蛋白+横断面I受试者中观察到的那样。可能是由于持续暴露于抗原刺激，抗原刺激通过脑淋巴管从临床前AD大脑排出到外周，最初的免疫反应被越来越多的耐受机制或免疫衰竭所消除。此外，这些最初的免疫反应是否真的对大脑或其他与AD相关的抗原实体中的有毒蛋白质聚集体具有保护作用，或者它们是否甚至加剧了病理学，还有待阐明。事实上，在衰老研究中，与年轻的对照受试者相比，认知健康、有潜在弹性的百岁老人外周血中的Effector T细胞数量似乎更高。相反，许多研究表明，在β淀粉样变性和AD的小鼠模型中缺乏适当的免疫反应。因此，可能希望具有较少耗尽的免疫细胞，例如PD-1⁺EM细胞和更多的抗原特异性Effector T细胞。为了进一步确定CD8⁺CD57⁺TEMRA/Effector细胞在AD病理中的重要性，需要确认这种细胞类型在AD脑组织中的存在和长期研究。总之，我们提出，外周的细胞免疫模式可以作为早期AD生物标志物变化的替代品。更好地了解这些免疫模式，结合详细的表位特异性分析，可能为鉴定新的复合生物标志物候选物铺平道路，并补充检测AD，特别是临床前AD的诊断工具箱。此外，了解这些过程的病理生理学意义可能会产生新的治疗策略。

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编  译：邱 钦 杰

校  审：梁 春 梅