引 言

脑胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，全球的年发病率为（5-6）/10万。目前，成人弥漫性胶质瘤的首选治疗方法是最大限度的安全切除及功能保留。手术可显著延长患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。然而，由于成人弥漫性胶质瘤具有广泛的侵袭性和浸润性生长的特点，肿瘤往往与周围的正常脑组织之间没有明显的边界，因此确定切除范围对于临床医生是一个巨大的挑战。对于不同亚型的胶质瘤，其切除范围有所不同。除组织病理学分类外，成人弥漫性胶质瘤手术策略的制定还取决于异柠檬酸脱氢酶（IDH）、ATRX、TERT、染色体1p/19q等分子特征，而IDH是最重要的分子生物标志物之一，术前或术中知晓IDH分子状态对个体化手术具有重要意义。因此，一种简单、快速、稳定的IDH分子状态快速检测（POCT）方法具有重要的临床意义。

成簇规律间隔短回文重复序列（Crispr）是原核生物基因组中的一段重复序列，它与Crispr相关（Cas）蛋白一起构成了Crispr-Cas系统，该系统利用RNA介导的核酸酶降解外源核酸。Crispr检测作为新一代的检测技术，在医学检测领域得到了广泛的应用。Cas12a是一种RNA引导的内切酶，它由一种自衍生的RNA（Crispr RNA，crRNA）引导，该RNA与目标双链DNA（dsDNA）互补。该酶在与目标dsDNA结合后，对切割单链DNA（ssDNA）具有强大的无差别活性。当切割dsDNA（称为“顺式切割”）时，它会触发短单链DNA（ssDNA）的侧支反式裂解，并允许荧光团从报告基团的猝灭剂中分离出来，从而产生荧光。 Crispr-Cas12a蛋白已在许多领域和方向上应用于临床诊断，如SARS-CoV-2、流感病毒以及人偏肺病毒（HmPV）等核酸的筛查及诊断。

本研究中，我们验证了基于Crispr-Cas12a方法快速检测IDH1-R132H位点突变（c.395G>a）在冷冻和新鲜胶质瘤组织样本中的可行性。

材料与方法

选取2019-2020年在中国人民解放军总医院神经外科进行脑胶质瘤手术切除，术后肿瘤组织保存在样本库中的62例成人弥漫性胶质瘤冰冻标本（组1）。另外纳入2021年11月至2022年3月新诊断的连续48例成人弥漫性胶质瘤组织样本（组2）。

纳入标准：1.患者年龄18岁以上，术后病理证实诊断为成人弥漫性胶质瘤，WHO分级2~4级（参考2021年WHO中枢神经系统肿瘤分类）；2.术后24小时内将肿瘤组织样品置于液氮保存，然后利用Crispr-Cas12a方法检测；3.患者或其家属签署了知情同意书。排除标准：1.患有其他恶性肿瘤的；2.术前接受放化疗、电场治疗、生物治疗等；3.伴有严重的细菌、真菌、病毒性传染病等传染病。

研究路线

操作流程

结 果

样本数据

组1中，经HE染色证实4例样本的肿瘤细胞的含量均低于10%，故剔除。ddPCR检测中，2例与术后直接测序和IHC不一致。术后IHC和直接测序方法均显示IDH1突变，而ddPCR均无突变（分别为0.08%和0.11%）。我们将这2例患者的样本视为IDH1-wt。组2中，2例经术后组织学和病理证实非弥漫性胶质瘤，故剔除。因此，共纳入104例成人弥漫性胶质瘤组织样本（组1冰冻组织样本58例，组2新鲜组织样本46例）。

Crispr-Cas12a方法检测稳定性与敏感度评价

实验所选引物及扩增产物稳定可靠。采用不同比例的IDH1-R132H突变型和IDH1-wt混合物模拟不同频率的IDH1-R132H突变，发现Crispr-Cas12a检测的相对荧光值与IDH1-R132H突变频率呈正相关，IDH1-R132H突变的最小检测频率理论上为1%。IDH1-R132H突变型和IDH1-wt的相对荧光截断值约为220。

首先，我们对组1中的58个样本（23个IDH1-wt样本和35个IDH1-R132H突变型样本）分别进行了3次平行独立的Crispr-Cas12a检测。将174例次的Crispr-Cas12a检测结果与金标准进行比较，绘制ROC曲线，AUC值为0.939（95% CI 0.900-0.975）。此时，相对荧光值的阈值为425，敏感性、特异性和一致性分别为91.4%（95% CI 0.845-0.954）、95.7%（95% CI 0.880-0.985）和93.1%（95% CI 0.883-0.960）。约登指数为0.871，McNemar检验显示，Crispr法与直接测序方法之间的差异无统计学意义。Kappa值为0.858，与金标准（直接测序方法）的一致性良好。

接下来，我们分析了第2组中46个样本的Crispr检测结果（每例样本依旧进行3次平行独立的Crispr-Cas12a检测）。根据组1的阈值（相对荧光值为425），结果显示在该阈值下的敏感性为98.0%，特异性为81.6%。ROC曲线分析得到的最佳阈值为525，敏感性为96.1%（95% CI 0.868-0.989），特异性为89.7%（95% CI 0.815-0.945），一致性为92.0%（95% CI 0.863-0.955）。约登指数为0.857，AUC为0.938（95% CI 0.893-0.983）（表4.3）。McNemar检验显示Crispr法与金标准（直接测序方法）之间无统计学差异。Crispr法的Kappa值为0.834，与直接测序法的一致性较好。

表1. 组1 CRISPR-Cas12a方法与金标准在IDH1-R132H检测中的一致性分析

表2. 组2 CRISPR-Cas12a方法与金标准在IDH1-R132H检测中的一致性分析

IDH是脑胶质瘤最重要的分子标志物，IDH基因状态往往与患者预后密切相关，并且可以指导胶质瘤手术的切除范围，优化手术策略。对于WHO 2~3级IDH突变伴1p/19q联合缺失的少突细胞瘤，考虑到良好的放化疗效果和肿瘤自身生长惰性，手术应着重神经功能的保护，通常不建议以牺牲功能为代价进行全切，少量残余肿瘤（＜5 cm³）不影响患者总生存期（OS）与无进展生存期（FPS）；而WHO 2~3级IDH突变的星形细胞瘤则需要尽可能的实现超出MRI所示的异常范围的安全切除，因为与全切组相比，即使是很小的手术残留肿瘤（＞0.1 cm³）患者OS依然有统计学差异；对于WHO 4级IDH突变的星形细胞瘤，在切除MRI增强病灶的基础上，切除MRI非增强病灶可延长患者OS；而IDH野生型的胶质瘤母细胞瘤（GBM）的手术策略则有不同之处，MRI非增强病灶的切除对预后改善似乎并不显著，手术切除范围还要考虑年龄因素影响。另外，有些疾病诊断上易于脑胶质瘤混淆，如有相似影像学特征的中枢神经系统脱髓鞘假瘤，术前或术中明确IDH突变可以有助于疾病的鉴别诊断。

目前术前、术中获取IDH状态信息的途径有限，尚未有完全成熟、普及应用的快速检测手段。IHC准确率高，可常规检测，但是不能术中诊断，快速免疫组化法（R-IHC）适用范围较窄；基于影像的机器学习模型可以术前评估胶质瘤基因状态，但是对于多中心样本，其检测稳定性欠佳。针对IDH突变下游的代谢产物2-HG也有许多检测手段；波谱作为一种无创的检查方法在临床实践作用很大，但是具有相似分子结构的分子波峰（如谷氨酸、谷氨酰胺）干扰结果判读；质谱法（MS）包括气相色谱或液相色谱MS、快速蒸发电离MS、触摸喷雾MS、解吸电喷雾电离MS、萃取纳米电喷雾电离MS和基质辅助激光解吸/电离质谱等，其中后四种可以实现即时检测，这种方法的不足之处有仪器昂贵、结果解读较复杂等。此外，高分辨率熔解曲线分析、微流体法等其他方法达到普及应用也尚需改进。因此需要一种更普适的快速检测IDH突变的方法。

直接测序是公认的诊断IDH突变的“金标准”，包括Sanger测序和NGS测序。NGS测序以其高通量、高准确度、相对低成本的优势已广泛应用于临床胶质瘤患者的诊疗。IHC法通过检测IDH1-R132H突变蛋白，最快能约3 h能得到结果，是胶质瘤术后常规检查项目，与NGS测序结果具有高度一致性，且成本更低，是替代NGS测序的首选检测手段。尽管这两种检测方法已发展得相当成熟，但是难以胜任术中检测。Crispr是近年的“明星分子”，先后被应用于基因编辑和核酸检测领域。Crispr的优势主要包括：（1）灵敏度高，能够对粗扩增后的样本进行检测；（2）反应速度快，成熟的Crispr/Cas工具及规范的操作流程可以在1h左右完成定性检测；（3）成本低，基于预扩增的单个Crispr诊断反应的成本约1美元；（4）可实现多种靶分子的同时检测。如上文所述，在体外诊断方面，Crispr/Cas工具已有成熟应用，故在检测成人弥漫性胶质瘤IDH突变方面有坚实的理论基础。

本研究利用Crispr技术初步验证了此方法检测成人弥漫性胶质瘤IDH1-R132H位点突变的可行性。优势主要在于可以在术中快速（50~60 min）、低成本地完成对此突变的即时检测；其次本研究首次尝试将Crispr法引入脑胶质瘤的快速分子诊断，具有一定的创新性。该方法可以进一步缩短检测时间，优化检测效能，并且未来可以拓展引入到其他分子的快速检测，如TERT基因突变、ATRX基因突变、MGMT启动子甲基化等。不足之处：首先未进行定量检测，但是缺少定量数据并不影响术中决策的制定；其次因考虑到IDH基因突变的其他位点的发生率较低，本研究只关注了R132H位点的突变，未涉及IDH2-R172K等其他位点突变检测，未来可以开发其他位点的检测。

冯世宇 教授

解放军总医院第一医学中心神经外科医学部

医学博士，主任医师，硕士生导师

中国抗癌协会脑胶质瘤专业委员会委员

中国医师协会脑胶质瘤专业委员会手术学组委员

中国医药教育协会神经外科专业委员会委员

北京抗癌协会神经肿瘤青年委员会副主任委员

研究型医院学会脑功能研究与转化专业委员会委员

余新光 教授

解放军总医院神经外科医学部

解放军总医院神经外科医学部，神经外科研究所所长

全军神经外科专业委员会主任委员

中华医学会神经外科学分会委员兼神经脊柱学组组长

曾任中国医师协会神经外科医师分会副会长

中国研究型医院学会脑功能研究与转化专业委员会主任委员

中国人工智能学会脑科学与人工智能专业委员会副主任委员

中国认知学会常务理事

以第一完成人获得军队科技进步一等奖，与清华大学合作荣获国家科技进步一等奖。现主持国家重点研发计划“重大出生缺陷三级防治示范建立应用与评价”、多项国家自然科学基金