海绵状血管畸形（Cavernous Malformation, CM）是中枢神经系统发病率第二位的出血性血管异常疾病（仅次于颅内动脉瘤），人群患病率高，约在0.16%到0.4%。海绵状血管畸形病变可反复出血引起相应的神经功能障碍，其中脑海绵状血管畸形是诱发癫痫的重要病因之一，而脊髓海绵状血管畸形具有严重的致残性。既往研究发现了家族性CM的三个相关致病基因CCM1（KRIT1）、CCM2（MGC4607）和CCM3（PDCD10），而占疾病85%的散发海绵状血管畸形也于近年被发现存在MAP3K3及PIK3CA体细胞激活突变。

该研究建立了只在中枢神经系统血管内皮细胞中表达 MAP3K3^I441M突变的脑和脊髓海绵状血管畸形小鼠模型，检测到与MAP3K3^I441M患者相似的病理表型，并通过双光子活体成像和基因标记的方法结合，观察到了MAP3K3^I441M过表达突变内皮细胞诱导脑海绵状血管畸形发生发展及破裂出血的动态过程，发现海绵状血管畸形始于突变血管内皮细胞扩张及血脑屏障的破坏。他们还发现，应用mTOR抑制剂雷帕霉素可以减轻MAP3K3^I441M诱导的小鼠脑海绵状血管畸形出血表型。这一工作为散发性脑脊髓海绵状血管畸形的发病机制提供了见解，并提出了一种潜在的治疗方案。

该研究得到国家自然科学基金（81971104, 32170964, 81971113, 82201440）等项目资助。

脑和脊髓海绵状血管畸形是中枢神经系统常见的出血性血管疾病，人群患病率约为1/200。这种血管畸形可以导致癫痫、出血和其他的神经功能缺陷。目前海绵状血管畸形处于“无药可治”的阶段，只能通过手术切除，而有些海绵状血管畸形位置过深，手术难度大，以及术后的并发症等因素限制了手术治疗。因此，探究疾病的发生机制，寻找潜在药物靶点是当前的关键问题。研究报道，约40%的散发性海绵状血管畸形患者中存在MAP3K3基因的体细胞突变，但不清楚MAP3K3单基因突变是否足以诱导海绵状血管畸形的发生。在这项研究中，我们建立了只在中枢神经系统血管内皮细胞中表达MAP3K3^I441M突变的脑和脊髓海绵状血管畸形小鼠模型，对其发病机制进行深入探究，并提出了一种潜在的治疗方案。

1. MAP3K3 ^I441M可以驱动不同年龄小鼠脑海绵状血管畸形的形成

为了研究MAP3K3^I441M在CCM形成中的作用，在出生后第35天（P35）将携带MAP3K3^I441M 的血管内皮靶向腺相关病毒AAV-BR1-CAG-MAP3K3^I441M-P2A-EGFP静脉注射到小鼠体内，注射后2周，MRI T2序列出现许多低信号的颅内病变，类似于人海绵状血管畸形。解剖及体视镜结果显示脑和脊髓中都存在血管病变。脑片HE染色和普鲁士蓝染色显示了内皮细胞排列的血管管腔扩张，在病变周围观察到出血和含铁血黄素沉积。小鼠MAP3K3 ^I441M诱导的海绵状血管畸形与MAP3K3^I441M患者的病理表型相似。不同月龄的小鼠（P5, P35, P150和P330）注射AAV-MAP3K3^I441M均出现了与人脑海绵状血管畸形相似的病变。这些发现表明MAP3K3 ^I441M(即一次打击)可以在幼年和成年小鼠中驱动脑和脊髓海绵状血管畸形的发生。

2. MAP3K3 ^I441M突变后CCM形成的双光子活体成像

为了更好地了解MAP3K3 ^I441M引起的CCM在体内的发展，我们使用经颅双光子激光扫描显微镜(TPLSM)分析了在P35注射AAV-MAP3K3^I441M后的NG2DsredBACtg和Pdgfrb-Cre::Ai14小鼠，在注射MAP3K3 ^I441M后2-3周出现新生血管异常，与患者观察到的表型相似。FITC-dextran染料注射后TPLSM延时成像分析显示在小血管中观察到大量扩大的血管管腔和血管出血，与人CCM的典型特征一致，并且观察到染料泄漏，表明CCM病变血管中的血脑屏障被破坏。在TPLSM下用线扫描测量了红细胞速度，结果显示在血管空洞中有湍流和停滞的血流，这与在患者中观察到的MAP3K3 ^I441M突变的CCM灌注减少相似。

3. MAP3K3 ^I441M驱动脑海绵状畸形的形成与内皮细胞增殖无关

为了确定MAP3K3^I441M过表达突变是否通过内皮细胞增殖机制驱动CCM的形成，给P35的 Cdh5-CreER::Ai14tg小鼠注射AAV-MAP3K3^I441M 4天后，通过注射EdU标记分裂细胞，在成像的50个MAP3K3 ^I441M突变的CCMs中没有发现分裂的内皮细胞，同样，在表达MAP3K3 ^I441M的CCMs的患者组织中对细胞增殖标志物Ki67进行了免疫组织化学检测，在CCM组织中几乎没有检测到Ki67阳性的内皮细胞。这些结果表明，内皮细胞增殖可能不是病灶形成的主要驱动力，这与我们在人类CCMs中获得的结果一致。进一步，MAP3K3 ^I441M诱导的血管管腔的大小与正常毛细血管相似，但表达MAP3K3^I441M的内皮细胞单个面积明显大于缺乏MAP3K3^I441M表达的内皮细胞面积。即CCM始于突变血管内皮细胞扩张及血脑屏障的破坏。此外免疫荧光染色发现AAV-MAP3K3 ^I441M感染小鼠病灶周围观察到许多p62小体，血管腔中有较高的cleaved caspase-3信号，表明病变可能与自噬及凋亡相关。

4. mTOR通路在表达MAP3K3 ^I441M的内皮细胞中被激活

为了进一步探索MAP3K3 ^I441M在内皮细胞中改变的潜在分子通路，采用慢病毒 lentivirus-MAP3K3 ^I441M (LV-MAP3K3^I441M-P2A-EGFP)感染小鼠内皮细胞系bEnd.3，以LV-EGFP为对照。RNA测序结果显示表达MAP3K3^I441M的细胞的转录组与对照细胞有显著差异，GSEA揭示了表达MAP3K3 ^I441M的内皮细胞中细胞骨架通路的结构成分上调。内皮细胞中富集的前8个肌动蛋白编码基因中，5个ACT基因在表达MAP3K3 ^I441M的细胞中表达上调。先前的研究结果表明，MAP3K3调节p62的磷酸化并促进mTOR的激活。Pull-down 实验及免疫共沉淀实验结果显示MAP3K3直接与mTOR相互作用。这些结果表明，MAP3K3的激活增加了mTOR通路的活性，这为雷帕霉素阻断mTOR后缓解MAP3K3^I441M诱导的CCMs小鼠的症状提供了直接证据。转录组学分析的结果表明，MAP3K3 ^I441M可以激活mTOR通路，导致扩张管腔形成前细胞骨架的改变。

5. 用雷帕霉素阻断mTOR活性可以阻止MAP3K3 ^I441M介导的CCM的形成

雷帕霉素是一种mTOR通路抑制剂，为了测试阻断mTOR通路是否可以减缓CCM的形成，我们给MAP3K3 ^I441M诱导的CCM小鼠给予雷帕霉素治疗。连续4周给药后，MRI和HE染色结果显示，雷帕霉素治疗显著减少了CCM病变的数量。为了进一步测试雷帕霉素治疗在病灶形成后是否有效，给老年小鼠注射AAV后2周开始雷帕霉素治疗，观察到雷帕霉素也可以在这些小鼠长时间暴露于MAP3K3 ^I441M后显著抑制CCM形成的进展。病理分析(自噬、微病变/出血和凋亡染色)发现雷帕霉素显著缓解了MAP3K3 ^I441M诱导的小鼠CCM表型，雷帕霉素治疗组病变密度和大小显著减小。此外，我们还发现雷帕霉素组自噬体数量显著减少。MAP3K3阻断剂Ponatinib (AP24534)治疗MAP3K3 ^I441M小鼠由于药物副作用没有继续治疗。

脑和脊髓海绵状血管畸形都是常见的中枢神经系统血管异常，虽然多种基因突变可能导致CCM的形成，但目前没有单基因突变能够诱导成年小鼠CCM的形成。因此，先前的研究主要提出了CCM1/2/3双等位基因失活突变的二次打击学说，或者包括CCM1/2/3失活突变和PIK3CA激活突变的三次打击学说。在小鼠中，只有在出生后早期发生CCM1/2/3的失活突变或PIK3CA的激活突变时才观察到CCMs。与CCM1/2/3和PIK3CA诱导的CCM不同，MAP3K3 ^I441M突变在散发性脑和脊髓海绵状血管畸形患者队列中被广泛发现，这强烈表明，一次打击机制可能是CCM形成的基础，我们的CCM小鼠模型的结果支持了这一点。MAP3K3 ^I441M在脑或脊髓内皮细胞中的特异性表达足以驱动CCM的形成。对小鼠进行EdU标记并未显示CCM病变中内皮细胞增殖的明显增加。因此，MAP3K3 ^I441M介导的CCM形成机制与MEKK3下游信号通路的简单激活不同，但这一结论必须在未来的研究中得到证实。

在表达MAP3K3 ^I441M的小鼠中，脑病变数量相对于脊髓CCMs更高，而在患者收集的脑和脊髓海绵状血管畸形中观察到相反的情况。根据我们在宣武医院对超过100例MAP3K3突变患者的临床经验和观察，MAP3K3 ^I441M突变患者发生中枢神经系统出血的可能性低于无此特异性突变的患者。由于MAP3K3 ^I441M患者在大脑中没有严重的症状，与脊髓病变患者相比就诊率可能较低，被诊断的概率也较低。由于脊髓直接参与各种感觉功能，MAP3K3 ^I441M突变引起的脊髓病变更有可能引起困扰患者的症状。

了解MAP3K3 ^I441M诱导的散发性CCM的启动机制对于开发针对约40%具有该突变的CCM患者的新疗法至关重要。我们的动物模型考虑了CCM发病时的出生年龄，将促使人们重新思考散发性CCM是如何形成的。该动物模型还将为CCM研究界提供一种研究散发性CCM患者的病变发展、出血和其他症状(如癫痫)的手段。我们的研究结果表明，MAP3K3 ^I441M突变通过激活内皮细胞中的MAPK和mTOR信号并改变细胞骨架，从而驱动脑和脊髓海绵状血管畸形的形成。此外，我们的RNA测序结果表明，MAP3K3可以直接与mTOR相互作用，MAP3K3 ^I441M诱导的CCMs可以通过mTOR抑制剂雷帕霉素治疗来预防。由于我们不能长期使用MAP3K3抑制剂ponatinib (AP24534)治疗CCM小鼠，因此我们无法评价其效果。