根据上述结果，我们探讨了Fatostatin对GBM迁移和侵袭的影响。通过伤口愈合试验，我们发现与DMSO相比，Fatostatin明显减弱了U87和U251细胞的迁移（图3A-D）。同样，Transwell实验显示，Fatostatin以剂量依赖的方式减少GBM细胞系的侵袭（图3E-G）。为了进一步探索Fatostatin在EMT中的作用，我们对GBM细胞的EMT相关基因，包括E-cadherin、N-cadherin、snail1和vimentin，进行了Western印迹分析。结果显示，Fatostatin处理后，N-cadherin、snail1和vimentin的表达以剂量依赖的方式下降，而E-cadherin的表达则上调（图3H，I）。这些结果表明，Fatostatin可能减弱甚至逆转U87和U251细胞系的EMT过程。

基于富集分析结果，我们进一步探讨了Fatostatin诱导细胞死亡的方式。我们用几种细胞死亡抑制剂（Z-VAD-FMK，一种典型的细胞凋亡抑制剂；necrosulfonamide，一种坏死诱导剂；ferrostatin-1，一种铁诱导剂）来处理GBM细胞，发现只有ferrostatin-1能逆转Fatostatin的作用（图4A）。此外，集落形成试验显示，ferrostatin-1逆转了Fatostatin引起的集落数量减少（补充图2A）。因此，我们接下来检测了铁死亡期间产生的GSH和脂质氧化（包括脂质ROS和MDA）的变化。结果发现，Fatostatin以剂量依赖的方式明显增加了脂质ROS水平和MDA水平（图4B，C）。同样，ferrostatin-1逆转了Fatostatin引起的脂质ROS水平的增加（补充图2B）。用Fatostatin处理后，GSH水平明显下降（图4D）。接下来，TME被用来观察U87细胞的微观结构的形态学变化。在Fatostatin处理组中，我们观察到典型的铁死亡特征，包括线粒体收缩，线粒体嵴收缩或消失，以及线粒体膜密度增加（图4E）。此外，去铁胺（DFO），一种铁螯合剂，可以逆转Fatostatin的作用，这证实了Fatostatin诱导死亡的铁依赖性（补充图2C）。

此外，我们通过检测ACSL4、SLC7A11、FTL和GPX4的表达，探讨了Fatostatin调节GBM细胞铁死亡的机制，这些蛋白是脂质氧化和铁代谢的核心调节蛋白。我们的结果显示，只有GPX4的表达在Fatostatin的处理下有负面的改变，而其他分子没有明显的变化（图4F，G，和补充图2D）。为了进一步验证这一发现，我们设计了一个带有Flag标签的GPX4过表达（OE-GPX4）质粒来进行拯救实验，并通过Western blotting确保了过表达的功效（补充图2E）。流式细胞仪结果显示，GPX4的过表达阻止了Fatostatin诱导的脂质ROS增加（图4H和补充图2F）。CCK-8检测也显示，过表达GPX4可以保留Fatostatin处理后U87和U251细胞的细胞活力（图4I）。上述结果表明，Fatostatin诱导的U87和U251细胞的铁死亡主要是由GPX4介导的。

然后，我们探讨了Fatostatin诱导的铁死亡中GPX4的上游调节因子。我们的RNA-seq结果显示，在Fatostatin治疗组中，GPX4的mRNA水平没有明显变化，这一结果也被我们的RT-PCR检测所验证（图5A）。考虑到GPX4蛋白水平下降而其mRNA水平没有相应的变化，我们推测GPX4蛋白合成减少或GPX4蛋白降解增加（或两者兼有）。因此，我们使用环己烷（CHX），一种蛋白质合成抑制剂，通过CHX追踪实验检测U87细胞中GPX4蛋白的半衰期。我们的结果显示，GPX4蛋白的半衰期在DMSO组和Fatostatin组之间没有明显差异（图5B，C）。此外，在Fatostatin处理下，用溶酶体抑制剂氯喹（CQ）或蛋白酶体抑制剂MG132处理后，GPX4蛋白水平没有恢复（图5D）。因此，我们得出结论，Fatostatin通过抑制GPX4蛋白的合成而降低GPX4蛋白水平。

mTORC1途径在蛋白质合成中起着至关重要的作用，Zhang Y等人发现mTORC1/4EBP的激活可以促进癌细胞中GPX4蛋白质的合成。结合我们的富集分析结果（图2B，J和补充图3），数据显示，Fatostatin处理后，AKT/mTOR信号通路可能受到影响。因此，我们通过Western blotting检测了AKT、mTOR、4EBP1以及它们相应的磷酸化蛋白的表达水平。结果显示，Fatostatin处理后，U87和U251细胞中p-AKT、p-mTOR和p-4EBP1的相对表达水平以剂量依赖的方式下降（图5E、F）。接下来，我们使用AKT激动剂SC79进行拯救实验，我们观察到SC79逆转了Fatostatin诱导的p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1和GPX4蛋白表达在两个GBM细胞系中的下降（图5G，H）。当我们使用mTOR激动剂MHY1485进行拯救实验时，也观察到类似的结果（图5I，J）。总之，我们表明Fatostatin对GPX4蛋白合成的影响是由AKT/mTORC1/4EBP1轴介导的。

随后，我们进一步研究了AKT/mTORC1途径对细胞增殖、EMT和铁死亡的影响。集落形成实验显示，SC79和MHY1485都能逆转Fatostatin处理引起的集落数量减少（图6A，B）。CCK-8实验表明，SC79和MHY1485可以恢复U87和U251细胞在Fatostatin处理后的细胞生存能力（图6C）。激活AKT/mTORC1途径后，Fatostatin诱导的GBM细胞侵袭能力下降以及EMT相关蛋白（包括E-cadherin、N-cadherin、snail1和vimentin）的表达也被逆转（图6D，E）。我们检测了加入SC79和MHY1485后GSH水平的变化，发现Fatostatin引起的GSH水平下降也被逆转（图6F）。我们通过TEM观察细胞的微观结构，发现加入SC79或MHY1485后，线粒体形态不再具有典型的铁死亡特征（图6G）。上述结果表明，Fatostatin通过AKT/mTORC1途径调控细胞增殖、EMT和铁死亡。

为了更好地将药物输送到肿瘤，我们设计并合成了装载Fatostatin的p28功能化PLGA纳米颗粒（p28-NPs-FAT）。图7A和B显示了Fatostatin、PLGA和PLGA-PEG-MAL的化学式以及纳米粒子合成的示意图。SEM结果显示，PLGA NPs-FAT（负载Fatostatin）的形态在用p28肽进行表面修饰后没有改变（图7C）。DLS结果显示，它们的ζ电位为-15.5±0.44mV和-17±0.81mV（图7D），其平均水化直径约为140nm（图7E）。两种NP之间的水化直径和ζ电位也没有明显差异。为了研究GBM细胞内化NPs和p28-NPs-FAT的能力，我们用合成的NP包被的C6（一种可以无创成像的荧光染料）进行了细胞摄取试验。结果显示，对照组只有很少的内化荧光颗粒，而在NPs组和p28-NPs组，荧光NPs均匀地扩散到整个细胞质。此外，与NPs组相比，p28-NPs组有明显更多的内化荧光粒子（图7F）。接下来，我们继续研究NPs-FAT和p28-NPs-FAT对GBM细胞系的增殖、EMT和铁死亡的影响。我们首先证明了游离NPs和p28-NPs对U87和U251细胞的生存能力没有影响（补充图4A，B）。然后，我们发现p28-NPs-FAT在抑制细胞活力和细胞侵袭方面发挥了最强的作用，并增加了铁死亡期间产生的脂质ROS（图7G-I）。不出所料，ferrostatin-1也逆转了NPs-FAT和p28-NPs-FAT诱导的U87和U251细胞的细胞活力下降（补充图4C，D）。这些结果表明，Fatostatin NPs增强了细胞对Fatostatin的吸收，在体外更好地抑制了GBM细胞。

为了评估NPs的递送效率，我们分别用游离的IR780（对照组）、装载IR780的NPs和装载IR780的p28-NPs治疗三组肿瘤小鼠。IVIS成像显示，对照组的小鼠颅内基本没有IR780颗粒，而p28修饰的NPs明显增强了IR780颗粒的积累（图8A）。同样，IVIS成像显示，除大脑外，其他离体器官的荧光强度没有明显差异，肝脏和肾脏的荧光水平在周边器官中最高（图8B，C）。这些结果表明，p28-NPs可以更好地穿过血脑屏障，靶向颅内GBM。接下来，我们进行了p28-NPs-FAT的体外释放实验，发现超过50%的Fatostatin在最初4小时内被释放，随后在72小时内持续释放（图8D）。此外，检测了p28-NPs在小鼠体内的药代动力学，结果显示p28-NPs的半衰期约为12.54小时（图8E）。

我们评估了Fatostatin和Fatostatin NPs在颅内异种移植模型中的GBM治疗。通过IVIS成像，我们证明游离NPs和p28-NPs对颅内异种移植模型中的肿瘤生长没有影响（补充图4E）。接下来，我们将携带GBM的小鼠随机分为四组，分别给予PBS、游离Fatostatin、NPs-FAT和p28-NPs-FAT处理。生存分析结果显示，游离Fatostatin、NPs-FAT和p28-NPs-FAT都延长了小鼠的生存时间，而p28-NPs-FAT组的生存时间最长（图8F）。1、3、5周的IVIS成像显示，游离Fatostatin、NPs-FAT和p28-NPs-FAT都抑制了小鼠颅内肿瘤的生长，而p28-NPs-FAT对肿瘤的抑制作用最强（图8G）。同样，HE染色显示，与PBS组的小鼠相比，p28-NPs-FAT治疗组的小鼠的肿瘤体积明显较小（图8H）。我们还通过IHC检查了p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1、GPX4、E-CA和N-CA在异种移植瘤中的表达水平，结果与体外实验的结果一致（图8I）。上述结果表明，Fatostatin可以在一定程度上抑制GBM在颅内异种移植模型中的生长，而负载Fatostatin的p28-NPs可以靶向GBM，更好地抑制GBM的生长。