2023年05月06日发布 | 1147阅读

【中国声音】西南医院冯华/胡荣团队发现抑制酸敏感通道蛋白ASIC1a可提升神经干细胞在脑卒中后的修复潜能

葛红飞

陆军军医大学第一附属医院

周腾渊

西南医院

张超

陆军军医大学第一附属医院

冯华

陆军军医大学附属第一医院

胡荣

陆军军医大学西南医院

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第一作者:葛红飞,周腾渊,张超

通讯作者:冯华,胡荣

作者单位:重庆西南医院神经外科

脑卒中(stroke)已经成为我国致残致死率排名第一的疾病,随着人口老龄化其发病率呈逐年增长的态势。近年来随着医学技术的进步,脑卒中的死亡率有所下降,但致残率仍居高不下。因此,寻求新的救治方法势在必行,如何调动自身干细胞参与损伤修复是很有前景的治疗方法之一。近年来研究表明:室管膜下区(Subventricular Zone,SVZ)的内源性神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)在脑损伤后,可以激活向损伤区迁移,但向伤灶的迁移能力有限,如何促进激活的NPCs向损伤区靶向迁移并进一步分化为不同细胞是基础与临床研究的关键科学问题。缺血性脑卒中后会激活很多病理过程,释放多种因子,比如脑缺血后能量以无氧代谢为主,导致乳酸堆集,加上ATP水解产生H,外加脑缺血后继发的兴奋性毒性、炎症反应、氧化应激等均可引起大量酸性物质的堆积,使得缺血核心区周围组织pH可下降6.5,严重时6.0以下。然而,脑缺血后微环境的酸化对内源性NPCs作用以及调控机制并不清楚。

近日,重庆西南医院神经外科冯华、胡荣团队在Research(IF:11.036/Q1 TOP)上发表了题为Targeting ASIC1a Promotes Neural Progenitor Cells Migration and Neurogenesis in Ischemic Stroke的文章,探索了缺血性脑卒中局部微环境酸化对干细胞的作用,发现微环境酸化可激活NPCs中的酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a),ASIC1a的激活通过RhoA信号介导的细胞骨架蛋白重组来抑制NPCs的迁移和神经发生,通过离在体实验发现药理阻断或基因干预技术可以逆转该现象,并改善了卒中小鼠的神经功能恢复。


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神经干细胞表达ASIC1a

鉴于ASIC可被细胞外酸化微环境激活并能发挥生物学效应,但NPCs是否表达酸敏感通道,既往未见文献报道。为了确定ASIC1a是否在侧脑室周围的NPC中表达,使用不同的NPC标记物和ASIC1a进行了免疫荧光染色。结果显示ASIC1a与Doublecortin(DCX)(图1A)、Nanog(图1B)、SOX2(图1C)和Nestin(图1D)共标,表明ASIC1a在成年小鼠脑中的侧脑室周围NPCs中表达。此外,体外实验显示ASIC1a与从SVZ来源的Nestin+细胞共标记(图1E)。总的来说,这些发现表明ASIC1a在NPCs中表达。进一步,通过体外培养的NPCs,利用膜片钳技术,验证了其电生理特性,酸化诱导的电流能被非特异性ASICs通道阻断剂阿米洛利(amiloride)和同聚体ASIC1a及异聚体ASIC1a/2b的特异性阻断剂PcTx1所阻断(图3F)上述结果表明ASIC1aNPCs中表达,并具有离子通道功能。


1. NPCs表达ASIC1a并能形成有功能的通道

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细胞外环境酸化可明显抑制NPCs迁移和神经发生

为进一步研究细胞外环境酸化对NPCs迁移的影响。首先,课题组将NPCs球接种于多聚鸟氨酸预先包被过的24孔细胞培养板中,利用活细胞工作站实时观察了细胞在不同pH培养液中,干细胞球向外迁移的细胞数量和迁移距离。实验结果表明:与pH7.4相比,在pH 6.5的情况下,NPCs自干细胞球向外迁移的数量及距离明显减少,且表现出酸度依赖性,酸度越低,抑制作用越强(图 2A-C)。其次,利用Transwell实验设置,观察了细胞自Transwell上层小室向下室迁移的细胞数目。结果表明:NPCs自上室迁移至下室的细胞数目在pH 6.5的情况下明显减少,且呈酸度依赖性(图 2D, E)。此外,作者在体外培养了SVZ组织块,模拟在体条件下观察细胞迁移能力。结果表明:随组织块外环境酸化程度加重,组织块细胞向外迁移的表面积较pH 7.4明显减少(图 2F, G)。以上数据表明:细胞外环境酸化可明显抑制NPCs的迁移能力,并且呈现出酸度依赖性,随酸度下降抑制作用增强。最后,用免疫荧光染色研究酸性条件对NPCs分化的影响。结果表明,与pH 7.4相比,pH 6.5时来自NPCs的MAP2+细胞百分比明显降低,而GFAP+细胞在pH 6.5时的比例明显升高(图2H-J)综上所述,这些数据表明,细胞外酸中毒激活ASIC1a会损害NPCs迁移和分化为神经元,从而抑制神经发生。


2. 细胞外环境酸化可明显抑制NPCs迁移和向神经元分化

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微环境酸化通过激活ASIC1a抑制神经干细胞迁移和神经发生

鉴于NPCs可表达ASIC1a,微环境酸化可激活该离子通道,文章进一步利用基因敲除技术探究细胞外环境酸化是否通过ASIC1a影响神经干细胞迁移和分化。在pH 6.5的酸性条件下,与正常NPCsASIC1a +/+相比,NPCsASIC1a-/-从细胞球中移出的数量和距离明显增加(图3A-C)。随后,作者检测了ASIC1a敲除对细胞分化的影响。来自NPCsASIC1a-/-的MAP2 +细胞百分比明显高于NPCsASIC1a +/+,而来源于NPCs ASIC1a-/- 的GFAP+细胞比例明显低于NPCsASIC1a +/+(图3D-G)


3. 酸化通过激活 ASIC1a 抑制神经干细胞迁移和向神经元分化

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ASIC1a阻断剂可以促进NPCs迁移和神经发生

上述结果提示:敲除ASIC1a促进NPCs迁移并向神经元分化。为研究ASICs阻断剂阿米洛利和PcTX1是否可发挥相似作用,用阿米洛利(20μM)或PcTX1(100ng/mL)处理NPCs。结果表明,与pH 7.4相比,pH 6.5时用阿米洛利或PcTX1处理NPCs,酸对NPC的迁移抑制作用显著改善,从细胞球中迁移出的细胞数量和迁移的距离明显增加(图4A-C)。而且,在pH6.5环境下,阿米洛利及PcTX1促进NPCs向神经元(MAP2+)分化,抑制向星形胶质细胞(GFAP+)分化(图4D-G)总的来说,这些结果表明ASIC1a的阻断剂可以促进NPCs在酸性条件下迁移和神经发生。


4. ASIC1a阻断剂可促进 NPCs 迁移和向神经元分化

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ASIC1a阻断剂或ASIC1a敲除可以促进脑卒中小鼠的神经功能恢复

为进一步评估干预ASIC1a对脑梗模型小鼠脑内NPCs迁移和神经发生的影响,一方面采用药理学阻断策略,野生小鼠在dMCAO前30 min脑室内分别注射2 μL人工脑脊液(aCSF)、含aCSF的阿米洛利和PcTX1(图5A-C)。研究发现,在阿米洛利或PcTX1处理的小鼠中,DCX+细胞的数量在缺血半暗带中明显增加。此外,用阿米洛利或PcTX1处理的小鼠GFAP+SOX2+细胞的数量在半暗带中显著增加(图5D和5E)。然后,对侧脑室和沿吻侧迁移流的NPCs进行BrdU免疫染色,检测ASIC1a阻断剂对NPCs迁移的影响。在脑梗造模后第14天,脑室内注射ASIC1a阻断剂可明显增加BrdU+Nestin+细胞的数量(图5F和5G)。这些结果表明ASIC1a阻断剂可以促进了NPCs从脑室下区迁移到缺血半暗带。同时,脑室内注射ASIC1a阻断剂增加了损伤区域周围BrdU+ MAP2+细胞的数量(图5H和5I),而减少了半暗带BrdU+ GFAP+的数量(图5J和5K)。最后进行行为学实验,探索予阿米洛利或PcTX1是否促进小鼠dMCAO后行为恢复(图5L-N)。结果显示,接受ASIC1a阻断剂治疗的小鼠比未接受治疗的小鼠呈现更好的行为恢复。另一方面,采用ASIC1a基因敲除动物建立脑梗死模型,与野生鼠相比,ASIC1a-/-鼠DCX+细胞的数量在缺血半暗带中明显增加,损伤区域周围BrdU+ MAP2+细胞的数量增多,而BrdU+ GFAP+的细胞数量下降,更重要的是行为学实验显示基因敲除鼠的神经功能比野生鼠恢复更明显。以上结果说明靶向ASIC1a干预策略可以促进缺血性脑卒中模型小鼠NPCs的迁移和缺血半暗带神经发生,进而促进其神经功能恢复。


5. 靶向ASIC1a干预可以促进脑卒中小鼠的神经发生和功能恢复


文章结论与讨论,启发与展望
中枢神经系统损伤后,NPCs激活可参与损伤修复和功能重建,但由于脑卒中后大脑微环境的剧烈变化,目前利用NPCs(内源性激活及外源性移植)治疗脑卒中的效果依然与理想相差甚远。局部微环境酸化是缺血性脑卒中常见的局部微环境变化之一。本研究初步揭示靶向干预ASIC1a可促进内源性NPCs的迁移和向神经元的分化,促进神经发生和神经功能恢复。此外,有研究表明:缺血性脑卒中发生后,应用NaHCO3可通过减轻脑缺血半暗带微环境酸化发挥神经保护作用。因此,针对脑卒中后微环境酸化或以ASIC1a作为靶点进行干预不仅可挽救受损的神经元,而且可促进NPCs向伤灶迁移,增强神经发生,促进神经功能恢复。该研究提示将ASIC1a或微环境酸化作为干细胞疗法的治疗靶点用于治疗脑卒中有可能获得良好的治疗效果,甚至可推广至其它存在微环境酸化的中枢神经系统病变。

原文链接:https://spj.science.org/doi/10.34133/research.0105
本文转载自:逻辑神经科学公众号


通讯作者简介



冯华 教授

重庆西南医院

教授,主任医师,博导

重庆西南医院神经外科学术带头人,全军神经外科研究所所长,国家973计划项目首席科学家,第十一届中国医师奖获得者,重庆市首批学术学科领军人才,重庆市首席医学专家,重庆英才名家名师

兼任中华医学会神经外科分会常委,中华医学会创伤分会常委,中国医师协会神经外科医师分会常委,中国医师协会神经修复学专业委员会副主任委员兼总干事,重庆市医学会常务理事

主要从事:1.出血性脑卒中防治研究;2.神经系统创伤的救治与神经功能重建;3.脑功能精准定位下脑肿瘤微创切除与光动力诊疗;4.前沿技术在脑科学的转化

先后主持国家973计划项目、国家自然科学基金国际合作项目、国家自然科学基金重点项目、重庆市攻关工程项目等各级科研项目50余项,科研经费10660余万元

获批发明专利26件,其中国际PCT专利8件;主编(译)专著11部,其中英文专著4部

发表SCI论文226篇(IF>10.0的16篇,IF>5.0的87篇),他引5181次

获国家科技进步二等奖1项,省部级一等奖7项


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胡荣 教授

重庆西南医院

教授、主任医师、博士生导师

重庆西南医院神经外科(国家重点学科、国家临床重点专科、重庆市神经外科临床研究中心)主任

国家重点研发计划项目首席专家、重庆市杰出青年、重庆英才•创新领军人才、高校创新研究群体负责人

兼任重庆市医学会卒中分会主任委员、中国医师协会神经修复学专业委员会委员、中华医学会神经外科学分会颅脑创伤专家委员会委员等

临床主要从事:1.神经内镜经鼻和经颅微创切除颅底肿瘤;2.脑出血精准诊疗与修复;3.多模态导航与术中唤醒下脑深部肿瘤精准切除

主要研究方向:1.脑卒中后神经损伤与修复;2.微环境与干细胞命运决定;3.脑出血诊治的多中心临床研究

主持国家重点研发计划项目、国家973计划项目子课题、国家自然科学基金项目等各级科研项目28项,牵头国内多中心临床研究1项,参与国际多中心临床研究1项

获批专利12项(其中PCT专利2项,发明专利7项);获“中国医师协会神经外科分会全国手术大赛一等奖”、“王忠诚中国神经外科优秀青年医师奖”、“踏血无痕脑肿瘤显微手术大赛第二名” 和“全军神外手术大赛银奖”


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现科室招聘科研岗位人员,有意愿者联系huchrong@tmmu.edu.cn

(一)科研PI岗位

1.医学、生物学、生物信息学、免疫学及相关专业;
2.年龄不超过50岁;
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(二)科研助理岗位

1.全日制硕士及以上学历学位;
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3.主持省部级以上科研项目或以第一(独一或共一排一)作者发表IF≥5 SCI论文的优先。


福利待遇:

1.年薪30万元-100万元(年薪面议);

2.在享受同级别聘用人员薪酬待遇基础上,具博士学位人员在引进的前三年,每月享受5000元博士津贴,三年后根据考核情况纳入医院优秀人才培养计划;

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