【中国声音】氧化苦参碱通过调节肠道菌群减轻小鼠脑出血后的脑白质损伤 - 脑医汇 - 神外资讯

第一作者：李静

通讯作者：孙海涛

作者单位：南方医科大学珠江医院

【Li J, Liang J, Zeng M, et al. Oxymatrine ameliorates white matter injury by modulating gut microbiota after intracerebral hemorrhage in mice [published online ahead of print, 2022 Dec 22]. CNS Neurosci Ther. 2022;10.1111/cns.14066. doi:10.1111/cns.14066】PMID: 36550632

摘要

引言：脑白质损伤（White matter injury，WMI）显著影响脑出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）患者的神经行为恢复。肠道生态失调在神经系统疾病的发病机制中起着重要作用。氧化苦参碱（Oxymatrine，OMT）对炎症介导的疾病具有治疗作用。OMT是否对ICH后的WMI具有治疗作用，以及肠道菌群在这一过程中的作用尚不清楚。

方法：观察脑出血后神经功能缺损、WMI、肠道微生物组成、肠屏障功能和全身炎症反应。通过粪菌移植（Fecal microbiota transplantation，FMT）来阐明肠道菌群在ICH发病机制中的作用。

结果：OMT可促进脑出血后远期神经功能恢复，改善血肿周围区域和远端皮质脊髓束（CST）区的WMI。ICH引起显著且持续的肠道菌群失调，OMT对其有明显的调节作用。此外，OMT还能减轻肠道屏障功能障碍和全身炎症反应。相关性分析显示，ICH后肠道菌群变化与炎症、肠屏障通透性和神经功能缺损显著相关。此外，OMT诱导的肠道菌群改变可对神经功能缺损和肠屏障破坏产生保护作用。

结论：我们的研究表明OMT通过调节肠道菌群改善ICH引起的WMI和神经功能缺损。

【关键词】粪菌移植，肠道菌群，脑出血，氧化苦参碱，脑白质损伤

介绍

脑出血（ICH）是第二常见的卒中亚型（10~15%），具有较高的发病率和死亡率，仍然是全球死亡和残疾的主要原因[1]。ICH后会出现血肿占位效应和出血引起的继发性损伤等一系列病理改变，包括血肿周围区域的神经元死亡、脱髓鞘、轴索变性和胶质瘢痕化等[2]。白质由轴突、髓鞘和支持神经胶质细胞组成。由于其在神经信号传递中的关键作用，皮质下白质损伤（WMI）和远端白质纤维束断裂都会产生严重的神经功能缺损[3,4]。一项临床研究报告，WMI是脑叶ICH患者的常见病理事件（存在于77%的患者）[5]，与运动障碍高度相关[6]。有趣的是，WMI表现出潜在的可修复特性，引起了越来越多研究者的关注。然而，人们更多关注的是脑原发病变周围轴索变性和脱髓鞘的进展和修复，而对脊髓白质纤维束，尤其是皮质脊髓束（CST）的病理改变及其在神经行为恢复中的作用知之甚少。脑出血患者同侧CST损伤的严重程度与日常生活能力障碍密切相关[7]。我们之前的研究首先揭示了纹状体出血导致了颈膨大处CST超微结构完整性的进行性破坏，这种破坏至少持续5周[8]。

越来越多的证据表明，肠道细菌是肠道和中枢神经系统之间双向交流的关键因素[9]。缺血性卒中和短暂性脑缺血发作患者表现出明显的菌群失调，其特征是有益共生类群的丰度较低，而机会致病菌的丰度较高[10]。在动物模型中，ICH引起显著的肠道生态失调和胃肠功能损伤，而移植健康微生物群的细菌疗法通过调节免疫应答促进了神经功能恢复[11]。NLRP3炎症小体是固有免疫系统的分子复合体，被认为是多种神经精神疾病发生和发展的关键因素[12,13]。越来越多的研究表明，NLRP3炎症小体在ICH的病理生理过程中发挥重要作用[14-16]。在我们之前的研究中，选择性地抑制NLRP3炎症小体足以调节肠道微生物组成，改善颈膨大的CST损伤和减轻ICH后的神经功能缺损[17]。因此，肠道菌群可能是脑出血进展的重要治疗靶点。然而，关于ICH后肠道菌群特征的研究仍然不足。

氧化苦参碱（OMT）是从中药苦参中提取的一种主要的喹利嗪类生物碱。新研究表明，OMT对几种神经系统疾病（如缺血性卒中和脊髓损伤）具有神经保护作用[18-20]。在临床前模型中，OMT通过抑制促炎信号通路来保护脑缺血再灌注损伤[18]。有研究表明OMT可以通过TLR4/NF-κB通路调节炎症、氧化应激和细胞凋亡，从而抑制急性脊髓损伤的进展[19]。然而，OMT是否对ICH后的WMI有治疗作用，以及肠道微生物群在这些过程中的作用尚不清楚。

因此，本研究旨在探讨OMT是否可以减轻脑出血引起的WMI，尤其是颈膨大的继发性CST损伤，以及肠道菌群在脑出血模型中的作用。我们假设OMT通过调节肠道菌群减轻ICH诱导的WMI和神经行为缺陷。

方法

本实验方案经南方医科大学珠江医院机构伦理委员会批准（LAEC-2020-227），按照国家卫生研究院实验动物保护与使用指南进行。实验方案参见图1A，具体略。

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析（SPSS，Chicago，IL，USA），应用GraphPad Prism软件6.0（GraphPad Prism，San Diego，CA，USA）对分析结果进行可视化，具体略。

结果

OMT可减轻ICH后的神经功能缺损

与溶剂处理的小鼠相比，口服OMT 3天减少了脑出血后的血肿体积和脑含水量（BWC，在同侧）（图1B、C）。然后我们通过qPCR研究炎症，发现在第3天和第14天，血肿周围区域的NLRP3炎症复合体（NLRP3，Asc和Caspase-1）和促炎细胞因子（Il-1β，Il-6，Tnf-α和Nos2）的mRNA水平显著升高。被OMT治疗下调（3日时的Il-6和14日时的Tnf-α除外）（图S1A、B）。

mNSS检测显示脑出血后第1天神经功能损伤达到高峰，之后从第3天开始逐渐下降。相反，OMT部分缓解了ICH诱发的神经功能缺损（图1D）。同样，OMT给药显著降低了ICH后右转的比例（图1E）。综上所述，这些结果表明OMT可以抑制血肿扩大和脑水肿的发展，抑制神经炎症，减轻神经功能缺损。

图1. OMT减轻了ICH后的神经功能缺损。

（A）ICH后OMT治疗的实验方案。（B-C）脑出血后3d的血肿体积（B，n=6~7/组）和脑含水量（%）（C，n=4~5/组）。于脑出血后1、3、7、14d进行mNSS评分（D，n=9~10/组）和转角试验（E，n=9~10/组）。假手术组与ICH+Vehicle组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ICH+Vehicle组与ICH+OMT组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

图S1. 在ICH后3d和14d时，口服OMT抑制了血肿周围区域的炎症（A-B）脑出血后3d（E，n=7~8/组）和14d（F，n=7~8/组）血肿周围区域NLRP3炎症复合体（NLRP3、Caspase-1、Asc）和炎症因子（Il-1β、Il-6、Tnf-α、Nos2）的mRNA水平。假手术组与ICH+Vehicle组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ICH+Vehicle组与ICH+OMT组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

OMT可减轻ICH后脑白质损伤和胶质瘢痕形成

我们通过MBP（髓鞘标志物）和NF200（轴突标志物）的免疫染色评估了白质的完整性（图S2A）。我们的结果表明，MBP和NF200被ICH明显破坏，导致MBP和NF200的平均荧光强度（MFI）急剧下降。在OMT治疗组中，它们的MFI显著增加（图2A，图S2A）。这些结果表明，OMT可减弱血肿周围的WMI。

随后，我们检测了MBP和NF200在宫颈增大的CST区域的表达，以进一步明确继发性WMI。结果显示，脑出血后NF200表达显著降低，与血肿周围区域一致，说明轴索华勒变性可能延伸至颈膨大的CST区域。OMT给药后NF200的MFI显著增加（图2B）。然而，在接受或未接受OMT治疗的ICH小鼠中，MBP在宫颈肿大中的MFI无显著差异（图2B）。这可能与轴索变性和脱髓鞘的异质性致病过程有关。我们的结果表明，OMT在ICH后14天减轻了近端和远端WMI。

胶质瘢痕的形成被认为是ICH后的另一损伤指标。硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPG）是一种细胞外基质化合物，来源于反应性星形胶质细胞，是轴突生长的主要抑制剂。通过GFAP和CSPG的共定位检测到大量活化的星形胶质细胞聚集在ICH后的血肿周围区域（图2C，图S2B、C）。在CST区域观察到同样的现象（图2D，图S2D），提示在脊髓远端WM中出现了类似的致病性改变。此外，脑出血诱导更多活化的小胶质细胞聚集在CST区，以响应轴突损伤和髓鞘破坏。而OMT治疗显著减少了CST区域的胶质瘢痕形成和小胶质细胞增生（图2C、D，图S2B-E）。我们的结果表明，OMT显著抑制脑出血后近端和远端WM的胶质瘢痕形成和小胶质细胞增生。

图2. OMT减轻了ICH后的白质损伤和胶质瘢痕的形成。

（A-B）ICH后14d免疫检测血肿周围区域（A）和颈膨大远端CST损伤区域（B）的MBP和NF200，并对其平均荧光强度（MFI）进行定量分析。第三列（A）代表性图像免疫荧光扩增为10×20，比例尺=100μm。第四列的图像是10×40，比例尺=50μm。n=5-6/组。免疫荧光视野放大度为10×40，比例尺=50μm。n=4-5/组。（C-D）脑出血后14d血肿周围区域（C）和颈膨大远端CST损伤区域（D）CSPG和GFAP的表达。免疫荧光视野放大度（C）为10×40，比例尺=50μm。免疫荧光放大图像（D）为10×20，比例尺=100μm。最后一列的白色框内的图像是10×40，比例尺=50μm。假手术组与ICH+Vehicle组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ICH+Vehicle组与ICH+OMT组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

图S2. 在ICH后14日时，OMT减轻了白质损伤和胶质瘢痕的形成。

（A-B）ICH后14d血肿周围区域的MBP和NF200（A），CSPG和GFAP（B）的免疫检测。视野放大度为10×20（A，比例尺=1000μm。n=5/组）和10×10（B组，比例尺=2000μm。n=5/组）。（C-D）血肿周围区域（C）和远端CST区域（D）的GFAP和CSPG双标记细胞的定量。（E）ICH后14d的远端CST损伤中IBA1的免疫检测。代表性图像的放大倍数为10×20，比例尺=100μm。n=5/组。从第三列内的白框导出的最后一列图像为10×40，比例尺=50μm。假手术组与ICH+Vehicle组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ICH+Vehicle组与ICH+OMT组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

OMT对ICH诱导的肠道菌群失调具有调节作用

为了研究脑出血后肠道菌群的组成以及OMT对这一改变的影响，我们采用16S rRNA基因测序。微生物谱分析显示，在ICH后的急性期，通过Shannon指数计算的α多样性表明，与假手术组相比，溶质组和OMT治疗组均显著下降（图3A，图S3A）。此外，通过基于加权UniFrac距离的PCoA分析，反映微生物群落差异的β多样性显示，ICH+Vehicle组样本在ICH后1和3d与Sham组样本明显分离。ICH+Vehicle组和ICH+OMT组仅在ICH后3日观察到这一现象（图3B，图S3B）。微生物群分析表明，ICH显著改变了肠道菌群的组成，而OMT处理在门和属水平上改变了肠道菌群的组成。LEfSe分析显示，与Sham组比较，ICH+Vehicle组ICH后1d时Rikenellaceae和S24_7的相对丰度显著升高，而Bacteroides、Parabacteroides、粪球菌属和变形菌门的相对丰度显著降低。而OMT显著增加了ICH后拟杆菌门（Bacteroides）、副拟杆菌门（Parabacteroides）和变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度，降低了Rikenellaceae的相对丰度（图S3C-F）。ICH后3d，拟杆菌门、Rikenellaceae和S24-7的成员过度生长，而以产丁酸菌为主的毛螺菌科、粪球菌科、瘤胃球菌科和颤螺菌科以及厚壁菌门、变形菌门、Desulfovibrionaceae和Desulfovibrio的其他微生物物种的相对丰度均显著降低。在OMT处理下，除变形菌门（Proteobacteria）外，其他菌门均有所增加，但无统计学意义，包括F/B比值。另一方面，与ICH+Vehicle组相比，ICH+OMT组中拟杆菌属、副拟杆菌属、螺杆菌属和阿克曼氏菌属的富集程度较高（图3C，图S4A-C）。

图3. OMT调节了ICH后3d的肠道菌群失调。

（A-B）比较颅内出血后3d三组间ɑ多样性（A，Shannon指数）和β多样性（B，基于加权UniFrac距离的PCoA分析）。（C）基于LEfSe分析的分布条形图（LDA评分（log10）>3），以及脑出血后3d三组间显著差异类群的丰富度。n=9/组。假手术组与ICH+Vehicle组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ICH+Vehicle组与ICH+OMT组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

图S3. OMT调节ICH诱导的肠道菌群失调比较。

ɑ-多样性（A，Shannon指数）、β-多样性（B，基于加权UniFrac距离的PCoA分析）、门水平（C）和属水平（D）肠道菌群分析、基于LEfSe分析的分布柱图（E）和进化分支图（F）[LDA评分（log10）>3]，以及ICH后第1、3天，组间不同类群的丰富度。n=8-10/组。假手术组与ICH+Vehicle组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ICH+Vehicle组与ICH+OMT组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

图S4. OMT调节了ICH诱导的肠道生态失调。

分别在脑出血后3d（A-C，n=9~10/组）、14d（D-F，n=9~10/组）和FMT（G-I，n=9~10/组）时，比较三组间在门水平和属水平优势微生物类群的相对丰度及基于LEfSe分析的分布图[LDA评分（log10）>3]。n=8-10/组。假手术组与ICH+Vehicle组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ICH+Vehicle组与ICH+OMT组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

如Shannon指数所示，在ICH后慢性期，ICH+Vehicle组的物种丰富度仍有显著下降（图4A）。PCoA分析显示，不同组的样本之间有明显的分离，表明不同组之间的肠道菌群组成有所区别（图4B）。通过LEfSe分析，我们确定拟杆菌门（Bacteroidetes）、S24-7、Paraprevotellaceae、普雷沃菌属（Prevotella）和阿克曼菌属（Akkermansia）成为ICH+Vehicle组的优势细菌，但上述物种（除阿克曼菌属外）的相对丰度在ICH+OMT组中显著降低（图4C，图S4D-F）。同时，ICH导致厚壁菌门（Firmicutes）、[Ruminococcus]和Turicibacter丰度降低，F/B比值降低。相反，与ICH+Vehicle组相比，拟杆菌属（Bacteroides）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）和Turicibacter在ICH+OMT组显著富集（图4C，图S4D-F）。所有这些结果表明，ICH引起明显的肠道菌群失调，而OMT可以调节肠道菌群。

图4. OMT调节了ICH后14d的肠道菌群失调。

（A-B）比较颅内出血后14d三组间ɑ多样性（A，Shannon指数）和β多样性（B，基于加权UniFrac距离的PCoA分析）。（C）基于LEfSe分析的分布条形图（LDA评分（log10）>3），以及脑出血后14d三组间显著差异类群的丰富度。n=9/组。假手术组与ICH+Vehicle组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ICH+Vehicle组与ICH+OMT组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

OMT可改善ICH后肠屏障破坏和肠源性内毒素血症

通过检测肠紧密连接蛋白的mRNA表达来判断肠屏障功能。靶基因ZO-1、Occludin和Claudin-4的mRNA水平在脑出血后3d和14d均显著降低。OMT处理显著上调了紧密连接蛋白的表达水平（图5A、B）。同时，我们评估了肠屏障的通透性。ICH后血清中FD4浓度在两个时间点均升高，OMT给药后FD4浓度降低（图5C、D）。综上所示，ICH导致肠屏障功能障碍，紧密连接蛋白降解和通透性增加，而OMT的应用显著逆转了肠屏障的破坏。

ICH后，LPS和TNF-α、IL-6、IL-1β等多种炎症因子的血清浓度明显升高，而OMT逆转了上述变化（图5E、F）。综上所述，OMT减轻了ICH后的肠源性内毒素血症。

图5. OMT改善了ICH后的肠屏障破坏和肠源性内毒素血症。

（A-D）紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin-4）mRNA水平（A，n=8/组；B，n=8/组）和血清FD4浓度（C，n=5/组；D，n=6/组）。（E-F）脑出血后3d（E，n=6/组）和14d（F，n=6/组）血清LPS和炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）浓度。（A）热图显示ICH后第3天（左）和第14天（右）微生物种类与损伤相关指标的相关性。红色和绿色细胞分别表示正相关和负相关。假手术组与ICH+Vehicle组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ICH+Vehicle组与ICH+OMT组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

脑出血后显著差异的微生物组分类与损伤相关指标的相关性

采用Spearman秩相关分析微生物种类相对丰度与损伤相关指标的相关性。ICH后3d拟杆菌门成员（Rikenellaceae和S24-7）与炎症标志物（IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS）、血清FD4浓度和行为学评分呈显著正相关，而与肠紧密连接蛋白（Tjs）的mRNA水平呈显著负相关。而厚壁菌门和变形菌门的微生物种类之间呈负相关，尤其是Lachnospiraceae、Desulfovibrionaceae、Ruminococcaceae、Oscillospira、Desulfovibio和上述标记之间，除了肠道Tjs的表达外（图6A）。脑出血后14d，拟杆菌门菌属（Paraprevotellaceae、Prevotellaceae S24-7、Prevotella）仍与上述标志物呈正相关，与Tjs表达呈负相关。虽然厚壁菌门（Firmicutes）、瘤胃球菌（Ruminococcus）和[Ruminococcus]之间呈负相关，而这些标记物的微生物类群（Firmicutes、Turicibacteraceae、Turicibacter、Ruminococcus）与Tjs表达呈显著正相关（图6B）。综上所述，部分微生物物种的相对丰度与ICH引起的病理变化显著相关。

图6. 脑出血后显著差异的微生物群分类与损伤相关指标之间的相关性。

（A）热图显示ICH后第3天（左）和第14天（右）微生物种类与损伤相关指标的相关性。红色和绿色细胞分别表示正相关和负相关。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

肠道菌群部分介导了OMT对ICH的治疗作用

我们进一步进行了FMT，以检测肠道微生物群在ICH致病过程中的作用（图7A）。在ICH后3日时，与ICH-粪便微生物群相比，ICH+OMT-粪便微生物群再定植显著降低了mNSS评分和右转偏倚（图7B）。对于肠屏障通透性检测，与ICH+OMT-fecal microbiota再定植的小鼠相比，ICH-fecal microbiota再定植的小鼠血清荧光素浓度较高，表明ICH+OMT-fecal microbiota再定植后肠屏障通透性较低（图7C）。此外，与FMT-ICH+Vehicle组相比，FMT-ICH+OMT组紧密连接蛋白的mRNA水平显著升高（图7D）。

此外，16S rRNA测序揭示了接受FMT 3天的受体小鼠的肠道微生物组成。FMT-ICH+Vehicle组的α多样性显著低于FMT-ICH+OMT组（图7E）。PCoA分析显示，FMT-ICH+Vehicle组和FMT-ICH+OMT组的样本分布明显分离，PC1轴的差异达到显著性（图7F）。群体分析表明，在门水平，FMT-ICH+Vehicle组的变形菌门丰度高于FMT-ICH+OMT组，而拟杆菌门丰度低于FMT-ICH+OMT组（图S4G）。两组间优势的7个属的丰度在属水平上存在差异（图S4H）。LEfSe分析结果显示，与FMT-ICH+OMT组相比，变形菌门成员（如Coriobacteriaceae、Enterobacteriaceae、EscherICHia、Adlercreutzia、线粒体、Desulfovibrio、假单胞菌属、葡萄球菌属和梭菌目）在FMT-ICH+Vehicle组中富集（图7G，图S4I）。而FMT-ICH+Vehicle组中拟杆菌门、拟杆菌科、拟杆菌属、副拟杆菌属、变形杆菌属和拟杆菌属的相对丰度显著低于FMT-ICH+OMT组（图7G，图S4I）。综上所述，OMT对ICH引起的神经功能缺损和肠屏障功能障碍的治疗作用部分是通过肠道菌群介导的。然而，潜在的机制需要设计更彻底的研究来研究。

图7. 肠道微生物群介导了OMT对ICH的治疗效果。

（A）ICH后FMT的实验方案。在脑出血后第3天，我们收集了接受或未接受OMT治疗的脑出血小鼠的粪便样本。受体C57BL/6J小鼠灌胃抗生素1周，然后进行ICH模型传导，然后每天接受FMT治疗3天。（B）脑出血后第1、3天进行mNSS评分（A，n=10/组）和转角试验（n=9~10/组）。（C-D）脑出血后第3天血清FD4浓度（C，n=6/组）和结肠组织紧密连接蛋白（D，ZO-1，Occludin，Claudin-4，n=8/组）的mRNA水平。（E-F）比较颅内出血后3dɑ多样性（E，Shannon指数）、β多样性（F，基于加权UniFrac距离的PCoA分析）。（G）基于LEfSe分析的分布条形图[LDA评分（log10）>3]，以及两组脑出血后3d显著差异类群的丰富度。n=9/组。假手术组与ICH+Vehicle组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ICH+Vehicle组与ICH+OMT组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

讨论

脑出血后WMI在神经功能转归中起重要作用[21]。本研究表明，ICH不仅可引起原发病灶广泛的WMI，还可在颈膨大处引起持续性继发性白质纤维束损伤，随后出现肠道生态失调、肠屏障功能障碍和全身炎症反应。口服OMT显著减轻ICH诱导的血肿区域和远端脊髓节段WMI，调节肠道微生物组成，改善肠道屏障功能障碍。FMT实验证实，ICH后肠道菌群参与了这一病理生理过程。

基线血肿体积和随后的血肿扩大是ICH术后死亡率和功能结局的预后因素[22,23]。此外，由占位效应和血液成分释放引起的继发性脑损伤，如水肿和炎症，在ICH术后神经功能恢复中也起着重要作用[24]。目前的研究表明，OMT（120mg/kg）通过减少血肿体积和抑制水肿的形成对脑出血具有神经保护作用。越来越多的研究表明OMT具有显著的抗炎和免疫调节作用。核苷酸结合寡聚化结构域，富含亮氨酸重复序列和热蛋白结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体是固有免疫系统的重要受体和感受器，可加重ICH后的炎症反应和脑水肿进展，选择性抑制NLRP3炎症小体活化可减轻ICH引起的脑损伤和神经功能缺损[14,25,26]。我们的研究表明，在脑出血后3和14d，OMT显著下调NLRP3炎症小体复合体和其他促炎细胞因子的mRNA水平，表明OMT可以有效抑制脑内的神经炎症。但OMT抑制NLRP3炎症小体和神经炎症的潜在机制仍需进一步研究验证。

脑出血患者WMI的严重程度与神经运动功能障碍密切相关7。在本研究中，OMT显著减轻了脑出血后14天血肿周围区域的WMI。原发灶WMI范围越小，脑出血后神经功能恢复越好。此外，ICH诱导的继发性远隔白质纤维束（如CST）损伤也在ICH的功能转归中起着关键作用。在卒中患者中，CST的完整性是运动障碍恢复比例的决定因素[27]。定量纤维束成像显示，预后良好的ICH患者有更多重建的CST纤维通路[28]。基于以上结果，OMT治疗可显著减轻ICH诱导的CST轴突损伤和颈膨大处脱髓鞘，其机制可能与OMT对原发灶WMI的保护作用有关，也可能与OMT抑制星形胶质细胞/小胶质细胞活化和炎症反应有关。长期以来，人们一直认为髓鞘碎片诱导的小胶质细胞长时间激活可通过分泌促炎细胞因子加重炎症作用[29,30]。而Cunha等揭示，小胶质细胞的促炎吞噬表型对髓鞘碎片清除和髓鞘再生至关重要[31]。在我们的研究中，小胶质细胞活化在OMT治疗后减轻，可能是由于OMT的直接抑制作用或较轻的CST损伤。此外，OMT在急性期和慢性期均显著改善ICH引起的神经功能缺损。较轻的血肿周围原发WMI和继发CST损伤可能是OMT治疗后较好的神经行为表现的原因。

肠道微生物通过微生物-肠-脑轴参与缺血性卒中的发生和进展[32]。使用来自特殊病原体无小鼠的卒中诱导的非生态微生物组重新定植后，无菌小鼠在大脑中动脉远端闭塞后出现了更大的梗死体积[33]。然而，肠道微生物群在ICH结局中的作用仍然知之甚少。有趣的是，当口服给药时，OMT会被胃肠道中的肠道细菌转化为更易吸收的代谢物苦参碱（MT）[34]。16S rRNA测序显示，口服MT显著改变了肠道微生物群落，产生了更有益的共生菌属，如ruminolostridium、Lachnospiraceae和Ruminococcaceae[35]。OMT是否调节肠道微生物组成尚不清楚。我们的研究结果表明，脑出血在连续的时间过程中引起持续的微生物组紊乱。OMT显著改变了ICH后的肠道微生物组成。相关性分析显示，细菌丰富度与ICH后炎症、肠屏障通透性和神经功能缺损显著相关。然而，关于不同细菌影响脑出血病理过程的确切机制尚不清楚。

肠损伤，尤其是消化道出血，是ICH患者的常见危重并发症，也是转归不良的重要危险因素[36,37]。在动物模型中，脑出血诱导肠屏障功能快速而持续受损和炎症[38]。Yu等人的另一项研究也发现ICH11后出现了胃肠功能障碍，增加了肠屏障通透性，破坏了肠的完整性。在本研究中，脑出血导致肠屏障完整性显著破坏，肠通透性增加，炎症因子和血液中LPS水平增加。OMT显著逆转了ICH引起的这些病理改变，并显著减轻了肠功能受损和循环炎症反应。

虽然我们的研究提供了口服OMT显著减轻ICH引起的神经功能缺损、肠道生态失调、肠屏障功能障碍和系统性炎症的证据，并且FMT证实了肠道菌群在这些病理过程中发挥着重要作用，但目前的研究仍有一些局限性。首先，药物在肠道内的细菌代谢通常会影响其药代动力学和疗效[39-41]。有必要进一步研究微生物组的OMT代谢物在脑出血中的作用。其次，OMT对肠道菌群代谢产物的影响有待进一步研究。第三，虽然FMT实验证实了肠道菌群在脑出血中的作用，但其潜在机制仍需进一步研究。

结

论

综上所述，我们的研究首次揭示了OMT治疗有效地降低了颈膨大的纹状体和远端CST区的WMI，改善了ICH引起的肠道生态失调，促进了肠道屏障的重建，并抑制了全身炎症反应。肠道菌群在OMT减轻ICH所致WMI中的作用仍需进一步研究。

缩写

BWC，脑含水量；CSPG，硫酸软骨素蛋白聚糖类；CTT，转角转弯试验；CNS，中枢神经系统；CST，皮质脊髓束；FMT，粪菌移植；GFAP，胶质纤维酸性蛋白；Iba1，离子钙结合接头分子1；ICH，脑出血；il-1β，白细胞介素-1β；il-6，白细胞介素-6；LDA，线性判别分析；LEfSe，线性判别分析效应量；LPS，脂多糖；MBP，髓鞘碱性蛋白；MFI：平均荧光强度；mNSS，改良神经功能评分；MT，苦参碱；NF200，神经丝蛋白200；NF-κB，核因子κB；NLRP3，核苷酸结合寡聚化结构域，富含亮氨酸重复和热蛋白结构域3；OMT，氧化苦参碱；PCoA，主坐标分析；SCI，脊髓损伤；Tjs，紧密连接蛋白；TLR4，toll样受体4；TNF-ɑ，肿瘤坏死因子α；WMI，白质损伤。

参考文献

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第一作者简介

李静

南方医科大学第二临床医学院

神经外科学硕士研究生，主要研究方向为脑卒中后的损伤修复机制

参与国家自然科学基金青年项目“HLA-G5介导的hAMSCs免疫炎症调节对ALS运动神经元的保护作用及机制研究”，广东省自然科学基金项目“CD200 介导的 hAMSCs 免疫炎症调节对脑出血小鼠模型神经修复的影响及机制研究”

截止目前共参与发表SCI论文7篇，总影响因子35.092分（JCR分区：二区6篇），其中第一作者论文3篇，单篇最高影响因子7.035分

通讯作者简介

孙海涛副主任医师

南方医科大学珠江医院

外科学（神经外科）博士，副主任医师、副研究员，硕导（神经外科学）

南方医科大学珠江医院临床生物样本资源中心主任

主要研究方向：脑重大疾病（出血性脑血管病、脑肿瘤等）基础与临床转化研究

学术任职：中国神经科学学会神经损伤与修复分会委员、中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会委员、中国医药生物技术协会组织生物样本库分会委员、广东省人类遗传资源保藏应用学会副会长兼理事等。任Stroke & Vascular Neurology、ACS Chemical Neuroscience、Journal of Inflammation Research等期刊审稿专家

作为项目负责人承担包括国家自然科学基金（青年1项）、广东省自然科学基金（3项）、香港HMRF等7项科研课题。以一作/通讯作者发表SCI收录文章10余篇，包括Cell Research、CNS Neuroscience & Therapeutics、Current Neuropharmacology、Molecular Neurobiology、Clinica Chimica Acta、Cancers等。获国家授权专利1项，申请国家发明专利4项。曾获选“香江学者计划”、“广州市珠江科技新星”、“广东省100位博士博士后创新人物”等人才项目及荣誉称号

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