撰稿 | AiBrain 内容团队

排版 | AiBrain 编辑团队

2022年11月16日，巴黎大学的Valérie Mezger课题组在Nature Communications上发表了题为“CBP-HSF2 structural and functional interplay in Rubinstein-Taybi neurodevelopmental disorder”的研究文章，该研究利用RSTS患者的细胞发现突变CBP或EP300会损害HSF途径的完整性和功能，从而影响短寿命HSF2蛋白的稳定性。

作者首先分析了HSF2和CBP/EP300在人脑类器官（hCOs）中的表达模式30分化第56天（D56）。使用免疫荧光标记，观察到HSF2和CBP/EP300蛋白在hCO增殖层和神经元层的细胞核中表达（PL，由SOX2或PAX6染色;NL，由TBR1或β III-微管蛋白染色）（图1a，b）。HSF2、CBP和EP300蛋白及其相应的基因转录本存在于hCO分化的D20至D60之间（图 1c），以及从E11到E17的小鼠皮层发育的所有阶段。作者还发现HSF2和CBP/EP300共定位于hCO增殖或神经元层的细胞核中。

此外，CBP和p300在发育中的小鼠皮层中与HSF2共免疫沉淀，并且HSF2不仅以乙酰化形式存在于发育中的小鼠皮层中，而且存在于D40 hCO中（图1d-f）。

总之，这些结果表明HSF2和CBP/EP300共存于增殖细胞和神经元细胞的细胞核中，并且这些蛋白质可以在神经发育环境中相互作用，这与HSF2在小鼠产前皮质和hCO中乙酰化形式的存在相关。

图1：HSF2在神经发育环境中表达、乙酰化并与EP300/CBP相互作用。

由于外源性标记的HSF2在HEK 293细胞中乙酰化（图1f），作者使用人HEK 293细胞共表达CBP-HA或EP300-HA和GFP或Myc标记的HSF2来检查HSF2是否是CBP/EP300的底物。结果显示，免疫沉淀的外源性HSF2蛋白被EP300或CBP乙酰化（图2a），但未被显性阴性CBP乙酰化，无法催化乙酰化（图2b）。为了鉴定HSF2中的乙酰化赖氨酸残基，从与EP300-HA共表达Flag-HSF2的HEK 293细胞中免疫沉淀HSF2，并通过质谱（MS）分析赖氨酸乙酰化。在HSF2的36个赖氨酸中，作者鉴定了8个乙酰化残基：K82（位于DNA结合结构域），K128，K135，K197（均位于齐聚HR-A/B结构域内），K209，K210，K395和K401（图2c）。这表明，与我们的MS数据一致，HSF2的乙酰化发生在多个赖氨酸残基上。

因此，作者定义了几种关键的乙酰化赖氨酸残基，其精氨酸（R）或谷氨酰胺（Q）突变显着降低了HSF2乙酰化：K82、K128、K135和K197（图2d）。为了剖析CBP在HSF2乙酰化中的要求，作者使用了体外乙酰化测定法与高效液相色谱（HPLC）相结合。结果显示，含有K135或K197残基的合成HSF2肽很容易通过CBP的纯化重组全催化结构域以乙酰辅酶A依赖性方式乙酰化，而含有K82的肽没有乙酰化（图2e，f)。综上所述，数据表明HSF2在三个主要赖氨酸残基（K128、K135和K197）中被CBP/EP300乙酰化，这些残基位于齐聚HR-A/B结构域内。

图2：HSF2在正常条件下被CBP和EP300乙酰化。

CBP/EP300对许多转录因子的锚定是通过不同的结合位点发生的，包括激酶诱导结构域（KID）相互作用结构域（KIX结构域）。作者在HSF2的HR-A/B结构域中发现了几个保守的，重叠的和并置的KIX基序（图3a）。

接着，作者模拟了HSF2 HR-A/B KIX基序与CBP KIX结构域之间的相互作用。基于HR-A/B结构域、脂蛋白Lpp56与转录因子GCN4、ATF2和PTRF之间的序列相似性，作者首先开发了HSF2三聚体三聚体三线圈HR-A/B结构域的结构模型。

最后，作者评估了CBP KIX结构域的Y650氨基酸的计算机突变的影响，这是一种在RSTS患者中突变的残基。CBP中的计算机突变Y650A大大降低了CBP KIX结构域与HSF2 KIX基序相互作用的概率（图3e）。使用重组蛋白，作者验证了HSF2在体外免疫共沉淀实验中直接与CBP KIX结构域相互作用，并确认Y650A突变破坏了HSF2和KIX相互作用（图3f）。综上所述，作者将Y650确定为CBP的KIX结构域与位于HSF2寡聚结构域内的KIX基序之间相互作用的关键残基。

图3：CBP和HSF2相互作用的建模。

由于HSF通路同时参与应激反应和神经发育，并且在存在突变的CBP或EP300时不稳定，因此可以直接参与RSTS的病理学。为了确定在这种病理背景下，受损的CBP和EP300活性对HSF2蛋白水平的功能影响，作者首先比较了来自健康供体（HD）或携带CBP或EP300基因突变或缺失的RSTS患者的细胞中HSF2蛋白的量（图4a）。

结果显示，两名RSTS患者的人原代皮肤成纤维细胞（hPSF）中的HSF2蛋白水平显着降低（图4a-c）。当用蛋白酶体抑制剂MG132处理这些hPSF时，HSF2水平恢复到相当的HD水平（图4b-c）；在抑制I类HDACs时，情况并非如此（图4b-c）。这一发现表明，催化HAT结构域和KIX域是调节HSF2稳定性所必需的，符合计算机结果。

总体而言，这些数据表明，HSF2的蛋白酶体周转在RSTS hPSF中增加，并且CBP和EP300是这种病理背景下HSF2蛋白稳定性的关键调节因子。

图4：RSTS患者细胞中HSF2蛋白水平改变和应激反应失调。

MG132导致HSF2水平升高。这种增加还伴随着RSTS iNPC和hCO中N-钙粘蛋白和HSP110水平的升高（图5a，b）。作者研究了NDE1，它是皮质祖细胞分裂的重要参与者，其基因与HSF2结合，但其表达不受小鼠发育皮层中HSF2的显着调节，与N-钙粘蛋白和HSP相反。重要的是，在RSTS神经环境中，NDE1蛋白水平对MG132暴露没有表现出重大变化（图5b）。这表明，在这些剂量下，MG132不能全局稳定HSF2靶标，无论是在HD还是在RSTS神经模型中。因此，在RSTS模型中，MG132治疗后HSP110和N-钙粘蛋白水平的升高可能是通过其强阳性调节因子HSF2水平的增加而发生的。

根据发现，N-钙粘蛋白水平降低可能是由于RSTS iNPC和hCO中HSF2的失调所致，与HD对应物相比，作者确定了RSTS衍生iNPC和hCO中神经发育特征的改变。结果显示， RSTSEP300 iNPC的径向组织发生扰动。在RSTS iNPC培养中未观察到FABP7 +放射状胶质样细胞的这种放射状组织。相反，PAX6 +细胞呈散在分布，即没有被FABP7 +细胞包围成簇(图5c)。这与小鼠Hsf2皮质(Hsf2^{-/- tm1mmr})的表型相似，后者显示出放射状胶质纤维组织的扰动。其次，通过使用磷酸化组蛋白H3标记物(H3S10Ph)对顶端有丝分裂进行染色，作者证明了RSTS_EP300 hCO与HD hCOs相比，在距离环的顶端区域(由ZO-1染色)有更高的异位有丝分裂率，具有统计学意义(图5d)。

图5：HSF2水平的药理学增强恢复了其在iNPC和hCO中的靶表达。