本研究探索TAM受体酪氨酸激酶家族中Mer对SAH后小胶质/巨噬细胞表型转化和神经炎症的调控作用及可能潜在机制，结果提示Mer参与SAH后小胶质细胞/巨噬细胞的表型转变和神经炎症消退，部分机制与STATs/SOCSs通路相关。

蛛网膜下腔出血（SAH）是高发病率和高死亡率的致命性脑血管病，早期脑损伤是导致患者预后不良的重要因素。早期脑损伤的机制复杂，潜在病理机制和治疗靶点仍需探索。小胶质细胞/巨噬细胞是中枢神经系统中的天然免疫细胞，在SAH后脑损伤中起着至关重要的作用。许多研究证实，小胶质细胞/巨噬细胞可以分为两种极化状态，命名为M1和M2表型。促炎M1型小胶质细胞/巨噬细胞分泌炎性细胞因子（IL-1b、TNF-a和iNOS）并加重脑损伤。抗炎M2型分泌与血管生成和组织修复相关的神经营养因子和抗炎细胞因子。既往研究表明，通过抑制M1表型和促进M2表型从而促进炎症的消退并加速修复可能是SAH的有效治疗策略。髓样上皮增殖酪氨酸激酶（Mer）属于酪氨酰肌醇（TAM）受体家族激酶，其对小胶质细胞激活发挥重要作用。在血脑屏障破坏模型中，Mer缺陷小鼠的小胶质细胞显示出较少的运动性和延迟向损伤部位的会聚。在创伤性脑损伤中，Mer通过增加小胶质细胞/巨噬细胞M2型极化和减少M1型极化来减轻神经炎症和脑损伤。STAT/SOCS通路已被证实与Mer介导的炎症反应密切相关。在本研究中，我们推测Mer可以调节SAH后的小胶质/巨噬细胞极化从而影响神经炎症，潜在机制可能与STAT/SOCSs通路有关。为了验证实验假设，我们检测蛛网膜下腔出血后Mer的表达及抑制Mer后神经功能缺损、脑水肿和小胶质细胞/巨噬细胞极化表型。我们测定下调Mer表达后STATs以及SOCS的激活水平，同时评估Mer激动剂治疗神经功能障碍和脑水肿情况，以进一步确定Mer在蛛网膜下腔出血后的作用。

本研究分为三个独立部分。实验组设计如图1所示。

实验1：探究SAH后Mer的时间轴和细胞表达定位，将小鼠随机分为5组，包括假手术组、SAH后12小时组、SAH后24小时组、SAH后48小时组和SAH后72小时组，进行western印迹和免疫荧光检测。在假手术组和蛛网膜下腔出血后24小时组中，使用荧光染色检测Mer的细胞定位情况。

实验2：为了确定Mer下调对SAH后病理过程的影响和机制，将小鼠随机分为三组，包括假手术组、SAH+Scramble（Scr）-siRNA和SAH+Mer-siRNA组。在所有组中测量死亡率、SAH分级评分、神经功能、脑含水量、western印迹和定量实时PCR。

实验3：为了进一步探索蛛网膜下腔出血条件下Mer激活的效果，小鼠被随机分为五组，包括假手术组、SAH+vehicle组、SAH+S蛋白组、SAH+Scr siRNA+S蛋白和SAH+Mer siRNA+S蛋白质组。测量各组的死亡率、SAH分级评分、神经功能和脑含水量。

Fig. 1. Experimental design, animal groups and mortality.

Fig. 2. Expression and distribution of Mer after SAH. (A) Representative western blotting images and quantitative analyses of Mer expression in ipsilateral basal cortex after SAH. n = 6. (B) Representative microphotographs of immunofluorescence double staining showing the localization of Mer (red) with Iba-1 (green) in sham group and SAH 24 h group. n = 3. Data are represented as mean ± SD (A). Scale bar = 50 mm. *P < 0.05 versus sham group. ** means P<0.01, ***means P<0.001.

下调Mer加重SAHA后的神经功能和脑水肿

Mer在SAH后高度表达，本研究进一步探索下调Mer对神经功能和脑水肿的潜在作用。Mer-siRNA导致SAH后Mer表达降低，接近假手术组的水平。评估SAH小鼠的SAH分级和死亡率时，我们发现造模组之间的SAH评分无显著差异，但Mer-siRNA组的死亡率略高于对照SAH组。下调Mer对SAH后神经功能和脑水肿的实验结果显示， Mer下调可导致神经功能障碍加重，表现为改良Garcia评分升高和行为学评分降低，同时恶化SAH后脑水肿。

Fig. 3. Effect of Mer on brain damage after SAH. (A) Representative western blotting image and quantitative analysis of Mer after Mer siRNA administration. n = 6. (B) Quantification of mortality. n= 20. (C) Quantification of SAH grade. n=20. (D-E) Quantification of neurological function with two different scoring systems at 24h after SAH. n = 20. (F) Quantification of brain water content. n=6. Data are represented as mean ± SD. ***P < 0.001 versus sham group. #P < 0.05 versus SAH + Scr siRNA group. ###means<0.001.

下调Mer促进小胶质细胞的表型转变

在探索下调Mer对大体神经功能和脑水肿的影响作用后，本研究继续探究下调Mer是否影响小胶质细胞表型极化而加重SAH后的早期脑损伤。结果显示SAH后皮层小胶质细胞表型发生转变，M1型和M2型小胶质细胞相关受体均在在转录和翻译水平显著升高。下调Mer增加了M1型小胶质细胞表面受体的表达，降低了M2型小胶质细胞相关受体表达。免疫荧光结果表明，Mer-siRNA组CD32和iNOS阳性细胞的数量显著增加，CD206和Arg1阳性细胞的数量显著减少。上述结果表明，下调Mer加重SAH后的早期脑损伤的作用可能与小胶质细胞表型转变相关。

Fig. 4. Effect of Mer on expression of microglial polarization marker after SAH. (A-F) Representative western blotting image and quantitative analysis of iNOS, CD32, CD206 and Arg1. n=6. (G-J) Relative mRNA expression of iNOS, CD32, CD206, and Arg1. n=5. *P < 0.05 versus sham group. #P < 0.05 versus SAH + Scr siRNA group. ***means<0.001. ##means<0.005. ###means<0.001.

Fig. 5. Effect of Mer on microglial polarization marker positive cells after SAH. (A-D) Representative immunofluorescent image and quantitative analysis of iNOS, CD32, CD206 and Arg1 positive cells. n=3. Scale bar=50 mm. *P < 0.05 versus sham group. #P < 0.05 versus SAH + Scr siRNA group. **means<0.005. ***means<0.001. ##means<0.005. ###means<0.001

Fig. 6. Inhibition of Mer decreased STAT1 activation and SOCSs expression after SAH. (A-D) Representative western blotting image and quantitative analysis of pSTAT1, SOCS1 and SOCS3. n=6. (E-F) Relative mRNA expression of SOCS1 and SOCS3. n=5. * P < 0.05 versus sham group. #P < 0.05 versus SAH + Scr siRNA group. **means<0.005. ***means<0.001. ##means<0.005. ###means<0.001

Mer激活缓解SAH后的神经功能缺损和脑水肿

本研究引入Mer激动剂蛋白S进一步确定Mer在SAH条件下的作用。激活Mer显著改善SAH后神经功能评分以及减轻脑水肿，蛋白S治疗略微降低SAH后死亡率。同时蛋白S的保护作用可被Mer-siRNA逆转。该结果间接表明抑制Mer的表达加重SAH后的脑损伤。

本研究探究了Mer在SAH后的病理过程并探讨相关机制，并取得以下主要发现：

（1）Mer的表达水平在SAH后逐渐升高，并在24h达到峰值；

（2） Mer主要位于小胶质细胞中；

（3） 抑制Mer加重神经功能障碍和脑水肿情况；

（4） 抑制Mer通过促进小胶质细胞激活和极化为M1表型而加重脑损伤；

（5） 抑制Mer介导的促炎作用部分由STAT/SOCSs信号通路调控；

（6）激活Me缓解SAH诱导的神经功能缺损和脑水肿。

Fig. 8. The schematic mechanism of microglial Mer modulates microglial/macrophage M1/M2 polarization and neuroinflammation after SAH. In the pathological process of SAH, Mer is upregulated and exerts protective effects via regulating microglial/macrophage M1/M2 polarization and neuroinflammation after injury. Specifically, inhibition of Mer by siRNA remarkably suppresses STAT1/SOCS signaling, thus decreasing microglial/macrophage M2-like polarization while increasing M1-like polarization after SAH.