【中国声音】#血流动力学冲击流激活JNK/c-Jun/p38/c-Fos途径诱导内皮细胞中MCP-1的表达 - 脑医汇 - 神外资讯

第一作者：朱华新，郝争

通讯作者：李美华

作者单位：南昌大学第一附属医院神经外科

[REF: Zhu H, Hao Z, Xing Z, Tan J, Zhao Y, Li M. Impinging Flow Induces Expression of Monocyte Chemoattractant Protein-1 in Endothelial Cells Through Activation of the c-Jun N-terminal Kinase/c-Jun/p38/c-Fos Pathway [published online ahead of print, 2022 May 14]. World Neurosurg. 2022;S1878-8750(22)00663-5. doi:10.1016/j.wneu.2022.05.032] PMID: 35580782

摘要

背景：单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是颅内动脉瘤形成和发展过程中的重要调节因子。本研究探讨了在血流动力学条件下诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）内MCP-1和炎症因子表达的相关分子机制。

方法：用改良的T型流室来模拟动脉分叉处的流体流动和壁面剪切应力。未加载冲击流的HUVECs作为对照组。通过Western blot检测ERK、JNK、p38、AP-1和MCP-1的蛋白表达水平，通过qRT-PCR测定MCP-1、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平。

结果：冲击流作用下，ERK、JNK和p38的磷酸化水平以及MCP-1、c-Jun和c-Fos的蛋白水平增加。MCP-1、IL-1β和IL-6的mRNA表达升高。使用JNK和p38特异性抑制剂预处理HUVECs可明显减弱MCP-1、IL-1β和IL-6的表达增加，而ERK特异性抑制剂则未表现出明显的效果。

结论：冲击流通过JNK/c-Jun/p38/c-Fos途径调节MCP-1和炎症因子，参与内皮细胞炎症反应。

图示说明冲击流如何调节HUVECs的内皮功能紊乱。在冲击流下，MCP-1和炎症因子通过JNK/c-Jun/p38/c-Fos途径被调节并参与内皮功能障碍。

关键词：HUVECs，MCP-1，JNK，p38，血流动力学

前言

颅内动脉瘤（intracranial aneurysm，IA）是最常见的脑血管病症之一，在普通人群中的发病率约为1-3%^[50]。IA通常是指动脉壁的异常膨出。IA破裂后，由于占位的影响，可引起颅内出血和血肿，进而导致颅内血管痉挛、脑组织损伤和脑水肿等并发症，严重威胁到患者的生命和健康^[17,56]。目前认为IA与许多因素有关，包括血流动力学变化、年龄、遗传、高血压和环境等^[31]。而对IA的形成机制需要更为深入的研究。

通过不断的深入研究，血流动力学在IA发生、发展和破裂中的重要性已经得到了多方面的证实^[36,37,64]。大量的临床和基础研究表明，IA通常发生在颅内血管的分叉处或颅内血管的弯曲部分。当血液通过这些血管时，会出现冲击流和复杂的血流动力学，导致血管内皮损伤以及血管壁炎症和重塑^{[21,34,36,47]}。这些变化是动脉瘤形成和发展的主要病理生理过程。血管内皮功能受损被认为是形成IA的一个重要的因素^[22,43]。当血液流经血管时，其粘度会产生摩擦，被称为壁面剪切应力（wall shear stress，WSS），在维持正常的细胞形态方面起着重要作用^[16]。高WSS导致血管壁扩张，最终破坏了血管内皮功能，进而促进IA的发展和断裂^[15]。有研究证实破裂的IA患者有更高的WSS^[9-11]。而血管分叉处的冲击流产生的WSS是复杂而多变的。

IA中伴随着各种炎症细胞浸润，其中单核巨噬细胞是主要的炎症细胞类型；炎症浸润伴随着各种炎症因子的高表达水平，包括白细胞介素（interleukin，IL）-6和IL-8，可以削弱或破坏动脉壁组织^[1,42]。在人类IA标本和啮齿动物IA模型中，观察到动脉瘤壁有大量的巨噬细胞浸润，而抑制巨噬细胞可明显减少动物IA的发生率，证实了巨噬细胞在IA形成中的重要性^{[23,25,44,63]}。单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）是C-C系列趋化因子的成员。其位于17号染色体q11.2-q21，包含三个外显子和两个内含子，成熟的MCP-1蛋白有76个氨基酸，对单核巨噬细胞有强烈的趋化诱导作用^[26]。MCP-1已被证实在未破裂和破裂的IA壁中高表达，并且下调MCP-1的表达后，可使动物IA的发病率明显下降^[27,59]。这些发现共同表明，MCP-1在IA的发生和发展中起着重要作用。

有丝分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPKs）在包括血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）在内的多种细胞中表达。MAPKs在细胞内信号转导中发挥重要作用，可以被包括缺血、剪切应力和血管活性物质在内的各种刺激激活。并且MAPKs调节了包括炎症、分化、增殖和凋亡在内的一系列重要的细胞生理功能，同时在调控细胞生存中也发挥了重要作用^[28]。MAPK家族重要的成员包括细胞外信号调节激酶（ERK）、p38和c-Jun N-末端激酶（JNK），其参与由细胞因子、细菌、物理和化学压力以及其他刺激诱发的细胞过程^[5,18]。激活剂蛋白-1（AP-1）是一个二聚体复合物，主要由Jun和Fos家族蛋白组装和合成^[35]。作为转录因子，AP-1参与各种生物过程，包括细胞增殖、分化、炎症和凋亡，并受MAPK途径激活的影响^[3,39,57]。

冲击流诱导内皮损伤的机制仍有待阐明。本研究探究了MAPK途径在冲击流下的EC炎症反应中的作用，并探索了MCP-1和炎症因子的调节模式。

方法

改良T型流室

本研究采用改良T型流室来模拟动脉分叉处的流体流动，以及WSS和壁面切应力梯度（wall shear stress gradient，WSSG）^[24,60-62]。图1A是改进后的T型流室的示意图。使用Fluent软件（Ansys, Canonsburg, PA, USA）对流室、流速、WSS、WSSG和湍流强度进行了模拟。我们实验使用的流速为500ml/min，WSS为18-36dynes/cm²，WSSG为0-140dynes/cm³（图1D，E）。实验装置在37℃下运行，冲击流作用时间为0、3或6小时。根据WSS的分布，载玻片上的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）分为三个不同区域。区域1受到低到中度的WSS和骤变的WSSG，而区域2受到高WSS和骤变的WSSG，区域3受到中度WSS和低且平稳的WSSG（图1B，C）。不加载冲击流影响的HUVECs构成静态对照组。

图1. 改良T型流室系统原理图：1.脉动阻尼器，2.橡胶管，3.螺纹接口，4.T型流室，5.压力表，6.流量调节器；7.蓄水池（A^[24]）。根据WSS的分布，HUVEC在同一玻璃片上被分为3个区域（B，C）。区域1受低至正常WSS和高WSSG的影响，区域2受高WSS和WSSG的影响，区域3受正常WSS和低WSSG的影响（C, D, E）。

细胞培养

HUVECs购自上海富恒生物技术有限公司。细胞培养按照标准操作准备和维持。HUVECs在EC培养基（ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA）中培养，补充有1%的EC生长补充因子、5%的胎牛血清和1%的青霉素/链霉素，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养。在暴露于冲击流6小时前将HUVECs在含有相应抑制剂的EC培养基中培养（JNK抑制剂-SP600125（10μM）；p38抑制剂-SB203580（10μM）；ERK抑制剂-PD98059（10μM））。所有的抑制剂均购自Abcam。对于细胞密度的量化，在光学显微镜下对每个区域的细胞进行计数。

免疫印迹分析（Western blot，WB）

收集所有三个区域的HUVECs并准备进行Western blot（WB）分析。细胞在含有苯甲基磺酰氟（PMSF）和蛋白磷酸酶抑制剂（北京索莱宝科技有限公司）的RIPA缓冲液中4℃下裂解30分钟。细胞裂解液在4℃、14,000×g下离心15分钟，提取上清。用BCA蛋白质检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）测定每个样品的蛋白质含量。将细胞裂解液和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）加载缓冲液（Beijing Solarbio Science & Technology）按相同比例混合，并在100℃的水浴中加热5-10分钟以变性蛋白质。冷却到室温后，将混合物在12,000×g下离心2-5分钟。通过SDS-PAGE分析变性蛋白，并转移到聚偏二氟乙烯膜进行免疫反应。膜在封闭液（5%牛奶和0. 1% Tween20 in Tris-buffered saline）中孵育1小后，使用一抗（ERK [ab184699]（1:1000）、p-ERK [ab201015]（1:1000）、JNK [ab179461]（1:1000）、p-JNK [ab124956] （1: 1000），p38[ab170099]（1:2000），p-p38[ab195049]（1:1000），c-Fos[ab184666]（1:1000），c-Jun[ab32137]（1:1000），MCP-1[ab214819]（1:1000）和β-actin[ab8226]（1:1000）；均购自Abcam）在4℃孵育过夜。用含0.1% Tween20的TBS中洗涤膜三次（每次5分钟），并用二抗（1:2000）（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）在室温下孵育2小时。使用Pierce ECL Plus Western Blotting试剂盒（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）检测蛋白质印迹。

基因表达分析

根据说明书操作，使用TRIzol试剂（诺唯赞）从HUVECs提取总RNA，并保存在-80℃。使用HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR试剂盒（诺唯赞）将RNA反向转录为cDNA。使用iQ5仪器（Bio-Rad）和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒（诺唯赞）通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测目标基因的表达。

统计分析

结果以平均值±标准误差表示。数据使用SPSS软件（19.0版；IBM公司）进行分析。组间差异的统计学意义是通过单因素方差分析来评估的，chisquare检验用于分析分类变量，P<0.05被认为具有显著差异。每个实验进行三次重复，以确保数据的总体准确性。

结果

HUVECs形态变化

冲击流作用下，1区、3区细胞密度无明显变化，2区血管内皮细胞密度下降明显，内皮细胞之间的间隙增大，细胞形态呈多样性。并且随着冲击流作用时间的延长，2区细胞密度呈进行性下降（图2）。

图2. 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在冲击流下的表现。随着冲击流持续时间的增加，第2区的细胞密度下降（A-B）（比例尺，50μm）。数据以平均数±平均数的标准误差表示。每个实验至少进行了三次。 *p<0.05, ***p<0.001。

MAPK激活和MCP-1以及炎症因子表达

将HUVECs暴露在冲击流中3或6小时，并从所有三个区域提取全蛋白进行WB。与静态对照组相比，ERK、JNK和p38的磷酸化随时间推移而增加。与静态对照组相比，c-Fos、c-Jun、MCP-1和炎症因子的表达水平都明显增加（P <0.05）（图3）。

图3. 有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）的激活和MCP-1和炎症因子的表达。在冲击流下，ERK、JNK和p38的磷酸化（A-C）随时间增加，MCP-1、c-Jun和c-Fos的表达水平增加（D，E）。MCP-1、IL-1b和IL-6的mRNA表达增加（F-H）。数据表示为平均数±平均数的标准误差。*p<0.05，每个实验至少进行了三次。*p<0.05，**p<0.01。ns，差异不显著。

JNK/c-Jun途径调节MCP-1和炎症因子的表达

在暴露于冲击流6小时之前，用JNK抑制剂SP600125（10μM）处理HUVECs。提取全蛋白用于WB。与没有抑制剂处理的组相比，JNK的磷酸化被SP600125抑制，c-Jun、MCP-1和炎症因子的表达水平明显下降（P<0.05）（图4）。ERK和p38磷酸化以及c-Fos表达没有明显变化。

图4. JNK/c-Jun途径调节MCP-1和炎症因子的表达。在暴露于冲击流6小时之前，用JNK抑制剂SP600125（10μM）预处理细胞；JNK的磷酸化减少（B），而细胞外信号调节激酶（ERK）（A）和p38（C）的磷酸化没有变化。MCP-1（D）和c-Jun（E）的表达水平下降，而c-Fos（E）的表达没有变化。MCP-1（F）、IL-1b（G）和IL-6（H）的mRNA水平下降。数据以平均值±标准误差表示。每个实验至少进行了三次。*p<0.05，**p<0.01。ns，差异不显著。

p38/c-Fos途径调节MCP-1和炎症因子的表达

在冲击流暴露6小时之前，用p38抑制剂SB203580（10μM）处理HUVECs。这导致了p38磷酸化激活的抑制，c-Fos、MCP-1和炎症因子的表达水平明显下降（P <0.05）（图5）。ERK和JNK的磷酸化水平，以及c-Jun的表达水平没有明显变化。

图5. p38/c-Fos途径调节MCP-1和炎症因子的表达。在暴露于冲击流6小时之前，用p38抑制剂SB203580（10μM）预处理细胞；p38（C）的磷酸化减少，而ERK（A）和JNK（B）的磷酸化没有变化。MCP-1（D）和c-Fos（E）的表达水平下降，而c-Jun（E）的表达没有变化。MCP-1（F）、IL-1b（G）和IL-6（H）的mRNA水平下降。数据以平均值±标准误差表示。每个实验至少进行了三次。*p<0.05，**p<0.01。ns，差异不显著。

抑制ERK的磷酸化对MCP-1和炎症因子的表达没有明显影响

在冲击流暴露6小时之前，用ERK1/2抑制剂PD98059（10μM）处理HUVECs。与未使用抑制剂的组别相比，ERK的磷酸化激活被PD98059抑制，而p38磷酸化和JNK、c-Jun、c-Fos、MCP-1和炎症因子的表达水平没有明显变化（图6）。

图6. 抑制ERK的磷酸化对MCP-1和炎症因子的表达水平没有明显影响。在暴露于冲击流6小时前，用ERK抑制剂PD98059（10μM）预处理细胞；ERK（A）的磷酸化减少，而JNK（B）和p38（C）的磷酸化没有变化。MCP-1（D）、c-Jun和c-Fos（E）的表达水平也没有变化，与MCP-1（F）、IL-1b（G）和IL-6（H）的mRNA水平类似。数据表示为平均数±平均数的标准误差。每个实验至少进行了三次。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。ns，差异不显著。

讨论

IA是一种囊状动脉隆起，主要是由于局部血管壁的异常变薄和扩张造成的。IA破裂是导致蛛网膜下腔出血（SAH）的主要原因，可导致高死亡率和高致残率^[48]。IA形成和破裂的机制尚未完全阐明，但许多研究将其与内皮功能失调、细胞外基质重塑和血管平滑肌细胞（VSMC）表型引起的血管系统病理变化联系起来^{[4,19,20,29,30]}。IA的生命周期有三个不同的阶段：形成、生长和破裂。在每个阶段，血流起着重要作用，机械刺激被转化为生物信号^[45,49]。大多数病变位于动脉分叉处或弯曲处，这一事实支持了血液动力学在IA生物学方面的重要性^[6,12]。复杂的流动模式决定了EC功能紊乱的定位^[40,51]。

EC构成的单细胞层是调节血管健康的重要部分；内皮层在整个血管网络中规则地排列，形成了对各种生理功能非常重要的分子屏障^[49]。在正常的生理条件下，血管ECs会变成梭形，从而与水流对齐，以调节血管张力、细胞粘附和平滑肌细胞增殖，并维持血管平衡^[7]。异常的血流动力学条件引发EC功能障碍和损伤；然后EC分泌基质金属蛋白酶（如MMP2和MMP），破坏细胞外基质^[41,47,54]。流动介导的内皮功能紊乱，随后VSMC从收缩型转向合成型（从而增强炎症反应）是IA的病理生理发展的一个关键步骤^[49]。合成表型通过创造一个有利于炎症和重塑的环境来促进许多血管疾病患者的炎症，这反过来又维持和扩大了内皮功能障碍和免疫细胞的招募^[38,46]。因此，内皮功能紊乱是IA的核心发病机制，而且可能确实是IA形成的最初步骤。我们在体外用改良的T型流室模拟了动脉分叉处的血流动力学，探讨了冲击流如何影响ECs的行为^[60]。我们的结果表明，冲击流破坏了HUVECS的细胞间连接，激活了细胞内的炎症反应，然后引发血管内皮功能障碍。

趋化因子MCP-1对单核细胞和巨噬细胞都有强大的作用。在破裂和未破裂的IA中都观察到大量的巨噬细胞浸润，抑制巨噬细胞可以显著减少IA的形成^[23]。与高WSS暴露相关的血流激活了血管ECs中的促炎症信号，导致巨噬细胞在暴露于高WSS的部位聚集并引发炎症反应^[14,21]。在之前的研究中，发现MCP-1在IA动脉壁上的高表达，并且MCP-1的敲除明显减少了巨噬细胞的浸润，证实了其在IA形成中的重要调节作用^[2]。在本研究中，我们在体外模拟了流体流动，发现HUVECs的MCP-1表达在冲击流下明显增加；这构成了MCP-1参与内皮功能障碍早期阶段的证据。

MAPK信号通路在从细胞表面到细胞内部的信号传递中起着重要作用；它还参与了细胞增殖、分化、转移、增殖和凋亡，以及压力和炎症。MAPK途径通过受体（包括G蛋白偶联受体）、蛋白激酶和转录因子向细胞传递细胞外信号^[18]。我们发现，ERK、JNK和p38的磷酸化被冲击流激活。我们用特异性抑制剂证实，JNK和p38分别通过c-jun和c-fos调节MCP-1和炎症因子的表达。尽管ERK对MCP-1和炎症因子的产生发挥了有限的作用，但ERK的磷酸化/激活会触发下游信号通路，参与调节细胞的生长、增殖、分化和迁移，并引起广泛的细胞变化^[8]。对IA和正常颞浅动脉组织中差异表达的基因进行比较后发现，ERK途径可能在IA的形成和发展中发挥重要作用。因此，ERK可能参与调节内皮功能障碍（通过其他生物途径）需要进一步研究^[58]。

冲击流通过激活JNK和p38来调节HUVECs的炎症反应，这可能通过调节内皮功能障碍参与IA的形成和发展。在IA的形成过程中，JNK和p38调节VSMCs的表型转化^[55]。与未破裂的动脉瘤相比，破裂的IA组织中JNK和p38的磷酸化增强，并与IA大小呈正相关^[32,33]。IA中可见ANXA3的水平升高和JNK信号活性增强；沉默ANXA3可以通过抑制JNK信号通路的磷酸化来抑制IA中VSMCs的表型转化^[52]。MiR-21通过JNK信号通路促进炎症相关因子的产生，参与IA的形成和破裂^[13]。在兔IA模型中，KLF2的上调增加了p38的磷酸化并调节了IA的进展^[53]。尽管许多研究发现JNK和p38参与了IA的发生和发展，但其调节活动的细胞过程非常复杂。目前还不清楚冲击流是否通过调节MCP-1和炎症（由JNK和p38介导）来参与IA。

我们的工作存在一定的局限性。首先，受冲击流影响的三个区域的细胞是一起收集的，我们没有对不同区域的细胞进行单独分析。考虑到玻片的尺寸有限，培养的细胞数量有限，而且细胞数量因冲击流作用而减少。若细胞是按区域收集的，其数量可能太少而无法进行后续分析。但鉴于测序技术的发展，特别是单细胞测序，我们以后可能会分析来自不同区域的细胞，加强我们关于冲击流对HUVECs的影响和体外相关信号通路的发现。此外，本研究缺乏动物IA模型的验证。第三，血管内皮细胞只构成动脉壁的一部分，构成动脉的其他部分仍需要进一步研究以确定其在IA中的影响。

结

论

在冲击流下，MCP-1和炎症因子通过JNK/c-Jun/p38/c-Fos途径被调节，参与了内皮功能障碍。然而进一步的体内实验验证是必要的。

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通讯作者简介

李美华教授

南昌大学第一附属医院

神经外科主任、主任医师、二级教授，博士研究生导师
江西省卫生系统有突出贡献的中青年专家、江西省百千万人才、江西省骨干教师和中青年学科带头人
2016年“侧颅底入路治疗复杂颅底肿瘤的临床应用”获科技进步奖二等奖（第一完成人）和2020年“颅咽管瘤诊疗新体系的构建及推广应用”获江西省科技进步奖一等奖（第二完成人）

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