近期，美国克利夫兰医学中心勒纳研究所的Aili Zhang等筛选GSCs缺氧反应中关键的DUB—USP33，应用免疫荧光染色、免疫共沉淀和原位GBM肿瘤模型等方法，确定USP33诱导HIF2α去泛素化及缺氧激活ERK1/2通路，进而促进GSCs缺氧反应作用，结果发表于2022年2月的《The EMBO Journal》在线。
——摘自文章章节
【Ref: Zhang A, et al. EMBO J. 2022 Apr 4;41(7):e109187. doi: 10.15252/embj.2021109187. Epub 2022 Feb 22.】
缺氧反应是胶质瘤干细胞（GSCs）的重要特征之一，其主要受缺氧诱导因子（HIF）调节，参与血管生成、诱导治疗抵抗和维持癌症干细胞性等过程。在调节缺氧反应和HIF表达过程中，泛素-蛋白酶体系统，尤其是去泛素化酶（DUBs），起关键作用。然而，与GSCs缺氧反应相关的DUBs及HIF调节机制尚不明确。近期，美国克利夫兰医学中心勒纳研究所的Aili Zhang等筛选GSCs缺氧反应中关键的DUB—USP33，应用免疫荧光染色、免疫共沉淀和原位GBM肿瘤模型等方法，确定USP33诱导HIF2α去泛素化及缺氧激活ERK1/2通路，进而促进GSCs缺氧反应作用，结果发表于2022年2月的《The EMBO Journal》在线。
作者首先发现USP33和HIF2α在GSCs缺氧条件下显著上调，随后应用免疫荧光染色、免疫共沉淀、质粒构建和慢病毒转染等方法，确定USP33诱导HIF2α去泛素化及缺氧激活ERK1/2通路，进而促进GSCs缺氧反应作用，最后建立颅内GBM模型明确USP33在GSCs干性维持和肿瘤生长等方面的作用。
研究结果有：
①缺氧激活GSCs中去泛素酶USP33表达，诱导HIF2α去泛素化。GSCs在缺氧条件下去泛素酶USP33和HIF2α表达显著上调。对原代GBM病理切片和缺氧诱导GSCs的免疫荧光染色检测显示，USP33主要在GSCs中表达，而且在缺氧条件下表达显著上调。随后，在分析USP33与HIF2α的相互作用发现，HIF2α与USP33表达呈正相关。通过敲除及过表达USP33时，GSCs中HIF2α表达相应地降低及升高。进一步泛素化分析显示，USP33在常氧和低氧条件下均显著降低HIF2α的泛素化。②缺氧激活GSCs中，ERK1/2磷酸化促进HIF2α与USP33的相互作用。在常氧和缺氧条件下，缺氧诱导GSCs的ERK1/2磷酸化，并提高HIF2α的表达。抑制缺氧诱导的p-ERK1/2后，HIF2α表达水平降低、泛素化增加，并削弱HIF2α与USP33之间的相互作用。进一步免疫共沉淀结果显示，与野生型HIF2α和S581A-HIF2α突变体相比，S484A-HIF2α突变体与USP33的结合最弱，而HIF2α上的S484A/S581A双突变不能进一步减弱HIF2α与USP33，因此，HIF2α上的S484A是负责介导HIF2α和USP33之间相互作用的关键磷酸化位点。③USP33参与GSCs干性维持、缺氧反应，并抑制GBM肿瘤生长。在常氧和低氧条件下，USP33敲低显著抑制GSCs细胞成球能力，缺氧进一步抑制GSCs细胞成球能力。此外，在常氧和缺氧条件下，USP33敲低抑制GSCs的增殖并激活caspase-3诱导细胞凋亡。随后，作者构建荧光报告基因4HRE-d2GFP以监测缺氧反应。USP33敲低显著抑制GSCs缺氧反应。进一步的免疫荧光染色显示，缺氧降低由USP33敲低激活的caspase-3表达。而在原位GBM肿瘤模型中，USP33敲低显著抑制肿瘤生长，并延长荷瘤小鼠的存活时间。进一步的机制研究显示，USP33敲低激活cleaved caspase-3表达、抑制增殖标记物Ki67表达及肿瘤血管形成。
综上所述，USP33是一种关键的缺氧诱导型DUBs，其能够去泛素化并稳定HIF2α，进而介导缺氧反应，促进GSCs干性维持及GBM肿瘤生长。同时，缺氧能够激活ERK1/2，促进USP33和HIF2α之间的相互作用，同样去泛素化并稳定HIF2α。因此，该研究率先明确USP33是负责HIF2α稳定和GSCs适应缺氧的关键DUBs，并确定ERK1/2通路在促进USP33与HIF2α相互作用、稳定HIF2α等方面的作用，为靶向GBM肿瘤低氧微环境中的GSCs提供新的治疗策略。
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