【中国声音】段炼教授团队：出血性烟雾病外泌体的蛋白质组学特征及内皮细胞线粒体功能障碍研究 - 脑医汇 - 神外资讯

共同第一作者：王霞1，韩聪2

通讯作者：段炼2，葛薇1

其他作者：贾阳杰1，王家钰1

作者单位：1中国医学科学院基础医学研究所；2解放军总医院神经外科医学部派驻第五医学中心神经外科

[REF:Wang X, Han C, Jia Y, Wang J, Ge W, Duan L. Proteomic Profiling of Exosomes From Hemorrhagic Moyamoya Disease and Dysfunction of Mitochondria in Endothelial Cells. Stroke. 2021 Oct;52(10):3351-3361. doi: 10.1161/STROKEAHA.120.032297. Epub 2021 Aug 2.] PMID: 34334053

背景

烟雾病（MMD）是以颈内动脉末端进行性狭窄闭塞伴烟雾状血管形成为特征的慢性进展性脑血管病，因其可以造成严重的卒中事件及卒中年轻化而逐渐被大众熟知。烟雾病发病机制仍不明确，目前认为平滑肌细胞增殖和迁移失调所致的血管内膜病理性增厚可导致烟雾病血管狭窄。同时，烟雾状血管具有不稳定性，以至新生的血管血流动力学应激可能造成了某些细小的侧枝血管出血。为了全面了解MMD中烟雾血管不稳定的蛋白质谱变化及其对血管内皮细胞的影响，本研究首先测定了缺血型MMD、出血性MMD和健康对照组血清来源的外泌体（SDEs）的蛋白质表达谱。然后我们探讨了致病性外泌体对脑血管内皮细胞的影响，以阐明其潜在的分子机制。

材料与方法

本研究对2014年到2017年8月就诊于解放军总医院第五医学中心的烟雾病患者进行筛选分组后取血清外泌体进行分离提纯，再采用TMT定量蛋白质组分析法，对比正常人及出血型MMD患者的血清外泌体（SDEs）分泌蛋白中找出可能致病的蛋白。用外泌体处理小鼠脑血管内皮细胞（EC）、人脐静脉EC、神经母细胞瘤细胞和人肝细胞后，检测发现小鼠脑血管内皮细胞中蛋白表达发生了变化。

图1. 样本信息

结果

1.蛋白质组分析

超速离心的方法提取烟雾病患者及健康对照血清外泌体，提取蛋白进行蛋白质组学检测，包括两次实验重复，两次实验同时检测到的蛋白共有859种，两次实验中表达量下调0.67倍和上调1.50倍的差异表达蛋白（DEP）的数量分别为264种及318种，其中两次重复中都升高的31种，均降低的200种。（如图2-ab所示）

图2. 烟雾病外泌体蛋白共表达及功能分析

2.蛋白质谱显示缺血性和出血性MMD患者血管系统细胞生长和维持失调

针对这231个DEP进行基因聚类分析（GOA），发现其中大部分共表达蛋白均为细胞骨架蛋白，参与细胞增殖和维持细胞结构及正常代谢。如CFL1（Cofilin-1）和ACTR2/3（肌动蛋白相关蛋白2/3，即ARP2/3）下调，进而可导致MMD患者细胞生长和维持异常，肌动蛋白动态紊乱。（如图2-cd所示）

3.出血性MMD蛋白表达异常提示免疫功能紊乱

生信分析显示cluster2中的蛋白出血型患者中表达较缺血组中高（图3-a），提示可能为出血型患者特异性表达蛋白。进一步分析发现，这些潜在的出血型患者特异性表达蛋白中多为免疫相关性蛋白，其中包括FCN1、FCN2、LBP、CRP、HP，提示这些蛋白所参与的免疫反应可能与烟雾病出血相关。（图3-bc）

图3. 出血型烟雾病特异性表达分析

4.MMD患者SDEs促进EC增殖

EDU细胞增殖实验显示随着加入纯化的外泌体的浓度的升高，烟雾病组相比健康对照组的外泌体对于小鼠脑微血管内皮细胞的增殖作用逐渐增强，当大于250µg后两组之间出现了明显的统计学差异，而全血和去外泌体血清对于小鼠脑微血管内皮细胞无增殖作用。（图4）

图4. 血清外泌体EDU细胞增殖实验

内皮细胞形成管状结构可以反映了细胞迁移、建立细胞-细胞和细胞-基质收缩以及调节细胞生存的潜力。我们发现由烟雾病患者和健康对照组提取的SDEs处理过的细胞形成管的能力没有任何显著差异。（图5）

图5. 血管内皮细胞成管实验

烟雾病血清外泌体对于不同细胞的表达方面：用MMD患者的SDEs进行处理后，小鼠脑血管EC细胞增殖水平与健康对照组相比明显升高，乙基-2-脱氧尿苷阳性细胞明显增多，而人脐静脉EC和人肝细胞均无明显变化。此外缺血型烟雾病血清外泌体对神经元细胞neuro-2a有促进增殖作用，可促进神经母细胞瘤细胞的增殖。（图6）

图6. 血清外泌体MTT细胞增殖实验

5.MMD患者SDEs诱导的脑血管内皮细胞线粒体功能障碍

基因聚类分析（GOA）显示，在细胞成分方面，外泌体刺激小鼠血管内皮细胞后所差异表达的蛋白多分为线粒体、线粒体膜、线粒体呼吸链复合物III和质子运输双区ATP酶复合物，提示小鼠血管内皮细胞bEnd3中线粒体调控异常。同时代谢和能量途径中的蛋白质出现了富集，也显示了线粒体功能障碍。

出血MMD患者血清外泌体诱导脑血管内皮细胞线粒体功能异常。富集分析显示，出血性MMD患者的SDEs作用于小鼠血管内皮细胞bEnd3后产生显著变化的蛋白主要富集于线粒体相关通路，包括线粒体基因表达、氧化磷酸化等。与健康对照组和缺血性MMD组相比，出血性MMD患者外泌体处理的小鼠血管内皮细胞中Ndufa9（NADH脱氢酶[泛醌]1α亚单位9，线粒体）、Ndufs8（NADH脱氢酶[泛醌]铁硫蛋白8，线粒体）、Ndufa2（NADH脱氢酶[泛醌]1α亚单位2，线粒体）、Uqcrfs1（细胞色素b-C1复合体Rieske，线粒体）、Uqcrc1（细胞色素b-C1复合物，线粒体）显著上调。由此可以推断，出血性MMD患者的SDEs影响电子传递链和氧化磷酸化途径，从而触发小鼠血管内皮细胞中的线粒体功能障碍。（图7）

图7. 出血型烟雾病患者作用小鼠血管内皮细胞蛋白差异表达分析

结论

近年来，细胞外泌体作为一种有价值的资源和生物标志物被研究用于不同疾病，包括癌症、阿尔茨海默病和其他中枢神经系统疾病。在这项研究中，我们对缺血性和出血性烟雾病患者的外泌体进行了蛋白质谱分析，并检测到了不同的蛋白质表达模式。我们发现出血型烟雾病患者血清外泌体中CFL1和ACTR2/3蛋白表达下调，可能与免疫功能障碍相关。在进一步的蛋白质组学分析中发现出血型烟雾病患者的血清外泌体蛋白表达异常，引起脑血管内皮细胞线粒体功能障碍，可能是烟雾病出血的潜在分子机制，从而为出血型烟雾病的机制研究提供了新的思路。而外泌体的相关研究很可能为烟雾病提供新的诊断及预后生物学标志物，是一个值得进一步深入探索的研究方向。

第一作者简介

王霞助理研究员

中国医学科学院基础医学研究所

以第一作者或通讯作者在Stroke、J Med Chem、Stem Cells等期刊发表论文15篇，发明专利1项
主持国家自然科学基金2项

韩聪副主任医师

解放军总医院神经外科医学部

解放军总医院神经外科医学部派驻第五医学中心神经外科主任
副主任医师，副教授，硕士生导师
军队高层次科技创新人才工程首批科技青年英才，北京市科技新星获得者，军队优秀专业技术人才岗位津贴获得者，解放军总医院“3+1”创新工程新秀人才
目前承担及完成国家自然科学基金项目2项，军队课题2项，北京市课题1项，解放军总医院院内课题1项
以第一及通讯作者发表SCI论文15篇，单篇最高7.91分，中科院TOP期刊3篇，累计影响因子54.506分，参编专著两部
2012年获军队医疗成果一等奖1项，2020年获军队科技进步一等奖1项
现兼任北京医学会神经外科分会青年委员，北京医学会神经外科分会转化医学学组委员，国家自然基金评审专家，北京市科委基金项目评审专家

通讯作者简介

段炼主任医师

解放军总医院神经外科医学部

主任医师，教授，博士生导师，专业技术三级
国务院政府特殊津贴和军队一类岗位津贴获得者，全军神经外科专业委员会副主任委员，中央军委保健委专家，北京市神经科学学会副理事长，北京医学会神经外科委员会常委
第一或通讯作者发表相关论文156篇，其中发表于《Stroke》等SCI论文共37篇，总影响因子126.132分
承担国家自然基金、北京市首发基金重点项目、后保部重大军事专项、军委科技委重点课题、国家重点研发计划等课题14项
主编出版了国内第一部《烟雾病》中文专著，牵头制定了《烟雾病治疗的中国专家共识》，参编中文教材2部
获军队医疗成果一等奖1项，军队科技进步一等奖1项；2014年获得新华网首届“中国好医生”称号，获得科普创新奖；2019年获白求恩精神研究会白求恩式好医生奖；2019年获解放军总医院优秀博士生导师奖；连续五年入选《中国名医百强榜》缺血性脑血管病TOP10

葛薇教授

中国医学科学院基础医学研究所

教授，博士生导师，协和学者特聘教授，牛津大学客座教授
主要研究方向为利用蛋白质组学和分子生物学技术研究蛋白间相互作用及寻找药物靶点
以第一作者或通讯作者身份在Nature Chemical Biology、Angewandte Chemie、Leukemia和Alzheimer’s & Dementia、Stroke等期刊发表论文60余篇，2篇被F1000推荐，国际PTC发明专利3项

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