文章来源：中国脑血管病杂志, 2021, 18(11):800-803.
作者：黄远翔 李文硕 徐文婷 冯子芯 陈荣 张祥建
基金项目:国家自然科学基金(81974184)
通信作者:张祥建,Email:zhang6xj@aliyun.com
摘要:中性粒细胞胞外杀菌网络(NETs)是中性粒细胞发挥细胞外功能所产生的由游离脱氧核糖核酸和蛋白质构成的网状结构｡NETs 生成主要涉及磷脂酰肌醇激酶3-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和丝裂原活化蛋白激酶-细胞外调节蛋白激酶等凋亡通路,并根据其生成是否依赖活性氧及是否导致中性粒细胞死亡分为“致死性”“非致死性”NETosis 等模式｡NETs 与缺血性卒中急性期及血栓形成期的炎性反应关系密切,并影响血-脑屏障功能及血管再生｡此外,NETs 与缺血性卒中的危险因素存在相关性,并可加重缺血性卒中的损害｡作者综述了NETs 的生成机制､相关通路以及NETs 与炎性反应､缺血性卒中相关危险因素的关系,以期进一步为急性缺血性卒中的药物干预和作用机制研究提供思路｡
急性缺血性卒中占我国全部卒中类型的69.6% ～70. 8% [1]｡随着中性粒细胞的非杀菌作用被发现,缺血性卒中—血管稳态—中性粒细胞—炎性反应间的关系成为了近年来研究的热点｡急性缺血性卒中后血管稳态遭到破坏,引起血管炎性反应及中性粒细胞的浸润,其中一种被称为中性粒细胞胞外杀菌网络(neutrophil extracellular traps,NETs)的中性粒细胞胞外产物在缺血性卒中后炎性反应中发挥着关键作用｡本文综述了NETs 的组成､生成机制､相关通路以及NETs 与缺血性卒中后炎性反应及相关危险因素的关系,以期进一步为急性缺血性卒中的药物干预和作用机制研究提供思路｡
1 NETs 的形成
中性粒细胞是机体抵御病原微生物入侵的一道防线,通常被认为发挥着免疫作用｡中性粒细胞通过释放NETs而杀菌的机制于2004年被Brinkmann 等[2]发现｡NETs 是中性粒细胞被激活后释放到胞外的一种以游离脱氧核糖核酸(cell free deoxyribonucleicacid,cfDNA)为骨架,其间镶嵌有组蛋白､中性粒细胞弹性蛋白酶､髓过氧化物酶､组织蛋白酶G 等蛋白的网状结构[2]｡NETs 的形成源自于一种被称为NETosis 的中性粒细胞死亡方式,这种死亡方式既非通常意义上的凋亡也非坏死｡一般认为,NETosis 分为3种模式:(1)“致死性”NETosis(suicidal NETosis):在中性粒细胞周期的最后阶段,核膜与胞质颗粒膜溶解,核内染色质与胞质内颗粒充分接触,随着细胞膜的破裂而排放到胞外,最终形成以DNA 为骨架,其上镶嵌着各种蛋白的网状结构[3],这种模式依赖还原型辅酶Ⅱ氧化酶使活性氧激活,从而促进核膜溶解进而形成NETs,中性粒细胞在形成NETs 后死亡[4];(2)“非致死性”NETosis(vital NETosis):细胞通过识别Toll 样受体和补体受体C3,激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)､磷脂酰肌醇激酶3 激酶(phosphatidylinositol 3kinase,PI3K)､酪氨酸蛋白激酶,使得核DNA 以胞吐等方式释放,“非致死性”NETosis 不依赖活性氧,NETs 生成后不影响原中性粒细胞的生命周期[5];(3)线粒体DNA NETosis,即细胞通过识别补体C5a 以及脂多糖,使线粒体DNA 取代核DNA 释放形成NETs[6]｡
2 形成NETs 的相关通路
NETs 的形成涉及众多通路,目前研究尚未完全明确｡尽管中性粒细胞形成NETs 的过程既非凋亡也非坏死,但凋亡相关通路在其中仍发挥着重要作用｡目前较为明确的通路主要包括PI3K -蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)-ERK 两条经典的凋亡相关通路｡此外,蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和肽酰基精氨酸脱亚氨酶4 在NETs 的生成中同样发挥着重要作用｡
PI3K-PKB-mTOR 通路在“致死性”和“非致死性”NETosis 中均有表达｡Douda 等[7]研究表明,在“致死性”NETosis 中,NETosis 与凋亡整体呈现对抗关系,使用丙二醇甲醚醋酸酯激活PKB,会增加NETs 的生成,同时抑制中性粒细胞凋亡｡在“非致死性”NETosis 中,PKB 同样高表达,使用PKB 抑制剂能抑制NETs 的生成,此过程受钙电流激活的小电导钾通道的调节[8]｡Yuan 等[9]的研究则指出,mTOR 对氢氧化钠诱导的NETs 的生成有负向调节作用｡
MAPK-ERK 信号通路是MAPK 相关信号通路中的主要通路之一｡MAPK 是胞内的一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,其在细胞进化中具有高度保守性。MAPK-ERK 通路可以在“致死性”NETosis 中发挥作用｡Hakkim 等[10]使用化学遗传分析方法对NETs生成进行研究,结果表明,MAPK-ERK 通路通过激活还原型辅酶Ⅱ氧化酶､上调抗凋亡蛋白而诱导NETs 的生成｡
PKC 亦属于多功能丝氨酸和苏氨酸激酶,其功能众多,与上述凋亡通路均有交叉｡在NETosis 中,PKC 的主要作用是激活还原型辅酶Ⅱ氧化酶｡DeSouza-Vieira 等[11]的研究表明,使用PKC 抑制剂能够显著降低寄生虫感染导致的NETs 的生成水平｡肽酰基精氨酸脱亚氨酶4 是中性粒细胞形成NETs 的关键催化酶,组蛋白需由肽酰基精氨酸脱亚氨酶4 介导转变为瓜氨酸化组蛋白,进而使染色质解旋,并随核膜破裂生成NETs[12]｡
3 NETs 与急性缺血性卒中后的炎性反应
急性缺血性卒中发生后,机体处于应激状态,免疫系统被激活,中性粒细胞会向梗死脑组织附近聚集并活化,部分活化的中性粒细胞离开循环系统并入侵血管周围组织[13]｡急性缺血性卒中后,梗死周围组织及循环血中肿瘤坏死因子､白细胞介素1､白细胞介素6 等炎性反应指标均显著增高[14]｡
作为中性粒细胞炎性反应的重要参与成分,NETs 在急性缺血性卒中后含量显著上升｡已有临床研究证实,相较于健康志愿者,缺血性卒中急性期患者血清中NETs 相关标志物水平显著上升(瓜氨酸组蛋白H3 上升72% ,游离DNA 上升33% ,核小体上升39%),并与美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分呈正相关(游离DNA:r = 0. 144,P =0.034;瓜氨酸组蛋白H3:r = 0. 210,P = 0. 002;核小体:r = 0.213,P = 0. 002)[15]｡在动物实验中,通过双光子活体成像技术发现,缺血性卒中急性期血清中的NETs 含量显著升高[16]｡急性缺血性卒中引发的炎性反应破坏血-脑屏障的紧密链接蛋白,从而对脑实质造成损害[17]｡Kang 等[16]的研究结果表明,使用抗Ly6G 抗体清除中性粒细胞或使用脱氧核糖核酸酶Ⅰ清除NETs 均可以显著降低缺血性卒中模型小鼠的血-脑屏障损害,并促进梗死后新生血管生成｡综上所述,NETs 在缺血性卒中后中性粒细胞导致的炎性反应及后续的血-脑屏障破坏过程中发挥着重要作用｡通过减少NETs 的生成而发挥缺血性卒中后的神经保护作用,或许是相关药物研发的途径｡
4 NETs 与急性缺血性卒中相关危险因素
部分缺血性卒中相关的危险因素,如糖尿病､恶性肿瘤､高血压病､高同型半胱氨酸血症等,会促进NETs 的生成,进而增加发生缺血性卒中的风险｡
2 型糖尿病会引发血管内皮的慢性炎性反应,进而破坏血管稳态[18]｡有研究表明,2 型糖尿病患者血栓形成前期,NETs 生成已开始增加[19]｡另有研究表明,机体处于高血糖状态时,还原型辅酶Ⅱ氧化酶会被激活进而促进NETs 的生成,并加重急性缺血性卒中后的神经功能损害[20]｡
恶性肿瘤可使血液处于高凝状态,增加脑血管病发生的风险｡NETs 与恶性肿瘤的关系是相互的,一方面,NETs 可以唤醒静止期的恶性肿瘤细胞,促进肿瘤细胞的新陈代谢[21];另一方面,恶性肿瘤也可以促进NETs 的生成｡有研究表明,恶性肿瘤患者体内NETs 的血清标志物水平显著增高,进而促进动脉微血栓形成[22]｡癌症相关缺血性卒中的最佳抗凝策略研究结果表明,相较健康对照组,恶性肿瘤相关缺血性卒中患者组的NETs 血清标志物显著上升[游离DNA:(40. 35 ± 12. 42)g/ L 比(30. 48 ±8.69 )g/ L,P = 0. 049;核小体光密度值:(0.379 ±0.371)比(0. 194 ±0. 199),P =0. 012],并与D-二聚体水平呈正相关(游离DNA:r = 0. 492,P < 0. 01;核小体:r =0. 323,P =0. 001)[23]｡
除了可以促进恶性肿瘤相关微血栓的形成,NETs 本身也参与了动脉粥样硬化斑块的形成｡通过将介入治疗取得的血栓染色后发现,中性粒细胞和NETs 的标志物在血栓内大量存在,其含量与血栓的成熟度呈正相关[成熟血栓与新鲜血栓内组蛋白C3 阳性细胞占比分别为(3. 23 ± 2. 76 )% ､(2. 03 ± 1. 63)% ,P <0. 05]][24]｡
高血压病是脑血管病的重要危险因素｡高血压状态下,中性粒细胞含量上升,而作为中性粒细胞发挥作用的重要途经,NETs 参与了高血压状态下的炎性级联反应[25]｡Chrysanthopoulou 等[26]研究表明,在原发性高血压模型中,血管紧张素Ⅱ可以通过活性氧-肽酰基精氨酸脱亚氨酶4 和相关自噬依赖性通路在体外诱导NETs｡已有研究表明,NETs 可以加剧血管内皮细胞的损伤[27]｡然而另有研究指出,在特定部位的高血压模型,如肺动脉高压模型中,NETs 可以通过一系列炎性反应促进血管再生[28]｡内皮损伤与血管再生并不矛盾,是血管稳态破坏时和破坏后不同阶段的炎性相关反应｡由此可见,NETs 在高血压病相关炎性反应中发挥着重要作用｡
同型半胱氨酸可通过还原型辅酶Ⅱ氧化酶依赖途径诱导NETs 的产生[29]｡在高同型半胱氨酸血症患者中,NETs 可以加剧血管内皮的损伤,进而破坏血管稳态[27]｡
综上所述,NETs 与糖尿病､恶性肿瘤､高血压病､高同型半胱氨酸血症等多种缺血性卒中的危险因素均具有相关性｡
5 展望
炎性反应与缺血性卒中及动脉粥样硬化的关系一直是卒中领域研究的热点｡同存在于脑实质中的小胶质细胞相比较,循环系统中大量存在的中性粒细胞在血栓形成期发挥的炎性作用更应被关注｡NETs 作为由中性粒细胞释放的cfDNA 和蛋白组成的网状结构,已经被证实在急性缺血性卒中的病理过程中发挥重要作用｡降低中性粒细胞活性或NETs 血清浓度对缺血性卒中后炎性反应可起到抑制作用,同时可以保护血-脑屏障｡但是,针对NETs的相关药物研究尚未见报道｡综上所述,NETs 与急性缺血性卒中关系密切,其相关机制及应用的大规模研究仍待进一步开展｡
