采用纳米孔测序检测脑脊液游离DNA诊断儿童高级别胶质瘤 - 脑医汇 - 神外资讯

美国密歇根大学密歇根医院神经外科的Amy K. Bruzek等对此进行研究，结果发表于2020年10月的《Clinical Cancer Research》在线。

——摘自文章章节

【Ref: Bruzek AK, et al. Clin Cancer Res. 2020 Dec 1;26(23):6266-6276. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-2066. Epub 2020 Oct 21.】

研究背景

儿童高级别胶质瘤（pediatric high-grade glioma，pHGG）主要位于脑中线部位或小脑幕下，常不能通过手术切除，目前的标准治疗包括姑息性放疗或化疗。诊断明确后，pHCG患儿2年存活率＜10%，预后极差。

肿瘤释放无细胞的游离DNA（Cell-free Tumor DNA，cf-tDNA）进入脑脊液（CSF），通过脑脊液样本可以检测与肿瘤相关基因的突变。pHGG的H3K27M突变率超过50%，常伴有肿瘤驱动基因ATRX、TP53、ACVR1、BRAF、EGFR和PIK3CA的突变；比常规活检术，取脑脊液进行分子诊断更安全、花费也更少。然而，微滴式数字PCR（ddPCR）或二代测序的技术复杂、耗时和花费大。因此，如何快速、准确、花费低地获得pHGG分子检测结果，是亟需解决的难题。美国密歇根大学密歇根医院神经外科的Amy K. Bruzek等对此进行研究，结果发表于2020年10月的《Clinical Cancer Research》在线。

研究方法

研究者使用手持式纳米孔测序平台（Oxford Nanopore MinION）对脑脊液cf-tDNA进行测序，并验证其特异性、灵敏性及检测极限等；同时在新的临床试验中对pHCG患儿脑脊液cf-tDNA连续多时间点测序，并与相应的临床症状、影像学表现作对比分析，评估治疗的多基因反应。

研究结果

结果获得以下研究数据：

1. 脑脊液cf-tDNA片段长度：对正常对照的脑脊液进行cf-DNA的检测分析显示，cf-DNA在139和636bp处有两个明显的峰，而肿瘤脑脊液在184、338和551bp处有三个峰，其中184bp的峰最大。

图1. 脑脊液cf-tDNA片段分析：正常对照CSF（灰色）、肿瘤CSF（红色）。

2. 脑脊液cf-tDNA纳米孔测序检测极限、效率及灵敏度与特异度：通过对脑脊液cf-tDNA多样本分析，纳米孔DNA测序检测极限为0.1飞摩尔、检测时长大约为12小时；同时检测灵敏度达85%、特异度达100%（图2）。

图2. 纳米孔脑脊液cf-tDNA测序的检测限和错误率。

3. 脑脊液cf-tDNA的H3F3A和HIST1H3B多重分析：对1例影像学诊断弥漫性内生性脑干胶质瘤（DIPG）患儿脑脊液样本多重纳米孔PCR检测，结果发现，其H3F3A K27M变异等位基因分数（Variant Allele Fraction，VAF）约为24%，而HIST1H3B VAF约为1%。ddPCR进一步证实上述结果。

4. 脑脊液cf-tDNA多时间点（连续）测序：对2例采用ONC201治疗的pHGG患儿的脑脊液样本进行cf-tDNA纳米孔测序，并作对应时间点（基线、2月及6月）的临床症状及影像学特征对比分析。患儿在UMPED77治疗6月后，临床症状及肿瘤体积无明显改变，H3K27M VAF基本未变化。患儿在UMPED60治疗2月时，其临床症状及肿瘤体积无明显改变，4个特异性突变基本保持不变或稍有增加；治疗到第6月时，其临床症状明显改善，而且肿瘤体积显著缩小；相应突变的VAF降低至原有水平的10%以下（图3）。以上结果表明，纳米孔测序可用于监测肿瘤对于ONC201药物的多基因分子反应。

图3. 脑脊液cf-tDNA基因反应临床试验模式图：A.ONC201临床试验时间线；B.ONC201临床试验UMPED77患者对应时间点的MRI（轴位，T1增强）；C.相应时间点脑脊液cf-tDNA H3F3A K27M突变纳米孔测序结果；D.ONC201临床试验UMPED60患者对应时间点的MRI（轴位，T1增强）；E.4个关键肿瘤驱动基因突变纳米孔测序结果。

结论

最后作者指出，检测脑脊液cf-tDNA基因突变是一种新的pHGG诊断手段；采用纳米孔测序具有以下优点：cf-tDNA超短片段测序所需样本量少、费时短及敏感度高，作为二代测序的可靠和敏感的替代方案可广泛用于pHGG诊断及监测治疗效果。在此基础上，作者建立新的用于pHCG患儿的临床试验方案：对pHGG患儿进行多时间点腰椎穿刺收集脑脊液，采用纳米孔测序对其连续检测cf-tDNA，动态监测其治疗效果及假性进展。

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