文丨张淑倩
《西游记》第四十六回师徒四人在车迟国与虎、鹿、羊三怪斗法，其中，鹿力大仙与孙悟空比试“隔板猜枚”，也就是在帘幕后将一件宝贝放入柜子中，大家猜测里面放的是什么。虽然鹿力大仙每一次都猜中了放进去的宝贝，但孙悟空却做法将木柜中的山河社稷袄变成了破烂僧袍，将一枚仙桃啃成了桃核，最后更是将柜子里的小道童剃了头变成了小和尚，真是大显神威，帮助三藏轻松取胜。
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提到肉毒杆菌毒素（BOTOX），人们首先想到的可能是它可以用来去除皱纹和瘦脸，其实除了医学美容方面的作用以外，其在肌肉痉挛和慢性偏头痛等疾病治疗方面都有着重要的地位。肉毒杆菌毒素是肉毒杆菌分泌的一种神经毒素，它是最强的神经毒素之一，能够阻断神经信号传递给肌肉，进而导致肌肉麻痹。
肉毒杆菌毒素是一种蛋白酶，目前已知有7种亚型（BoNT/A ~ BoNT/G），它们都由一条重链和一条轻链构成，重链负责靶向神经细胞，并将轻链递送到细胞内部，轻链则负责特异性切割神经递质囊泡与细胞膜融合的相关蛋白（SNARE蛋白），从而阻止神经递质乙酰胆碱从囊泡中释放，而乙酰胆碱是使得肌肉收缩的化学信号。因此，肉毒杆菌毒素是通过阻断这一信号通路而使得肌肉无法收缩的（图1）。
图1. 肉毒杆菌毒素阻断神经与肌肉间信号传导的机制示意图
肉毒杆菌毒素具有多种理想药物的特征，它的效力非常强，在低剂量就能够产生很强的效果，而且它能够进入细胞内，切割细胞内的靶位点。研究者则想通过改变肉毒杆菌毒素的底物特异性，去切割其他种类蛋白，为治疗其他疾病提供新的方法。
人们探索具有新功能和特性的酶一般通过两种途径，一是从大量未知的生物种系中去寻找，二是人工改造现有的已知酶。而在人工模拟自然进化过程的条件下，通过容错PCR、随机引物引导重组和递增截短技术等方法对已知酶的基因进行突变和体外重组，经过高通量筛选获得性能更优良或全新的酶，这种方法称为酶的定向进化，而这项技术也于2018年获得了诺贝尔化学奖。
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刘如谦团队开发的PACE系统将噬菌体的繁殖能力与特定蛋白的活性联系起来，成功改造了肉毒杆菌毒素的底物特异性。他们对三种不同肉毒杆菌毒素家族中的4种蛋白酶进行了改造，使得它们可以特异性切割磷酸酯酶与张力蛋白同源物（PTEN），而后者对神经再生具有阻碍作用。由此，通过切割PTEN，这些改造后的肉毒杆菌毒素可能为促进神经再生提供新的治疗手段。
PACE系统主要由一个堪比魔术箱的Lagoon生物反应器构成，其中含有M13噬菌体及其宿主大肠杆菌。噬菌体能否被正确包装，是否具有感染力取决于M13噬菌体基因组中的gIII基因所编码的蛋白质pIII。大肠杆菌还有一些自身质粒，可编码T7 RNA聚合酶（其活性被T7 溶解酶所抑制）以及由T7 启动子所控制的gIII。M13噬菌体感染大肠杆菌后，其基因组会被转入大肠杆菌，所编码的蛋白酶可以识别并切割T7 RNA聚合酶和T7溶解酶之间的多肽连接，从而激活T7 RNA 聚合酶，开始转录gIII，噬菌体恢复其感染活性。大肠杆菌内还存在着一些能够表达提高DNA复制时突变的蛋白的质粒，这样噬菌体DNA在复制时便可引入突变。只有具有感染性的噬菌体才能通过不断地感染新的大肠杆菌而留在这个反应器之中。通过这种方式可以进行大量筛选，极大地提高了分子进化速度。
为了可以降低新进化的蛋白酶对原始底物作用的活性，研究者在大肠杆菌宿主中正向选择的系统上，又添加了一个反向选择质粒，它可编码T3 RNA 聚合酶和T7 溶菌酶，以及一个由T3 启动子控制的显性失活gIII。当噬菌体所编码的蛋白酶同时激活gIII 的表达以及显性失活gIII的表达时，这样新的噬菌体没有感染力，进而也不会存留在这个反应器中。反言之，只有新进化的活性而没有原始活性的蛋白酶会被筛选出来（图2）。
图2. PACE系统模式图
首先研究者利用PACE系统将肉毒素X的作用活性向VAMP4和Ykt6进化，得到的突变体对这二者的偏好性相较于VAMP1有了很大程度的提升。接下来研究者又利用PACE的正向筛选系统将肉毒素F进化得到F(3041)B6突变体，它具有切割VAMP7的活性（目前已知的肉毒素都不能切割VAMP7），但同时还保留原始对VAMP1切割的活性。研究者又经过了反向筛选系统，得到另一种突变体F(3230)A3，它同时具有很高的VAMP7切割活性以及极低的VAMP1切割活性（图3）。
图3. F(3230)A3突变体体外酶动力学曲线
接着研究者又进行了更加有挑战性的工作，即进化出可以特异性切割非SNARE蛋白的突变体。他们将靶向切割SNAP-25的肉毒素进化使之具有PTEN切割活性。PTEN，是迄今发现的第一个具有双重特性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重特异性，在细胞内多条信号传导途径调控中起着重要作用。PTEN脂质磷酸酶的活性可使PIP3去磷酸化转变为PIP2而失活，继而抑制Pl3K/AKT通路，抑制细胞的生长、调控细胞周期。癌细胞中PTEN功能的丧失几乎总是导致PIP3的积累和相关的AKT信号的激活。在受损的中枢神经元中敲除PTEN可以极大地提高神经元的再生能力。
研究者通过正向、反向筛选系统最终得到突变体E(4130)A2，在体外酶活实验中，E(4130)A2对PTEN有较高的切割活性，且对SNAP-25的切割活性极低（图4）。
图4. E(4130)A2突变体的体外酶活实验
而将E(4130)A2与PTEN共同表达于HEK293T细胞中时，没有观察到其对于PTEN明显的切割活性。研究者考虑到PTEN作用位点于细胞膜，而突变体E(4130)A2主要存在于细胞质，因此没有观察到明显的切割效果。接下来研究者将定位于细胞膜上的PH结构域与E(4130)A2融合表达得到PH-E(4130)A2时，可观察到PTEN的表达水平明显下降（图5）。
图5. E(4130)A2突变体对HEK293T细胞中PTEN的降解
随后研究者在体外培养的大鼠皮质神经元中表达PH-E(4130)A2，同样观察到了PTEN表达水平下降以及极低的SNAP-25切割活性。而后又引入的新的突变L167A则可使其完全丧失切割SNAP-25的活性（图6）。
图6. E(4130)A2突变体对大鼠皮质神经元中PTEN的降解
总而言之，这项研究不仅体现出噬菌体辅助持续进化技术（PACE）在生物分子人工快速进化上的强大优势，还证实了人类可以改变、定制蛋白酶的底物特异性，略施魔法便可使其“改头换面”具有全新的功能！当人类可以根据需要修改遗传基因，定向改造出特定的蛋白质时，便可真正显法成为主宰自身命运的“神”。
参考文献
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