01. OGD后，SNAP29蛋白水平持续下降

首先，作者在体外培养的原代皮层神经元中进行了氧糖剥夺（OGD）实验。通过将细胞培养基更换为无糖培养基并在缺氧培养箱中进行处理，氧糖剥夺实验可以在体外培养细胞中很好地模拟缺氧缺血的状态。

蛋白质印迹（Western blots,WB）结果显示，氧糖剥夺以及不同的再灌注时间下，SNAP29的蛋白量表现出持续下降的趋势。高内涵细胞成像分析也证实了这一蛋白水平的变化（图1A-C）。为了确定SNAP29蛋白量变化的原因，作者接下来采用实时定量PCR手段检测了Snap29的mRNA含量。结果显示再灌注后1小时（OGD/R 1 h）和12小时组（OGD/R 12 h）中Snap29的mRNA含量均出现了显著的下降，但这并不包括再灌注前（图1D）。这一结果提示，氧糖剥夺初期SNAP29蛋白量的下降可能是转录后的调控因素所导致的，而SNAP29的生物发生则是导致其再灌注阶段蛋白量降低的原因。

泛素-蛋白酶体途径是一种高度特异性的蛋白降解途径，这一途径可能在SNAP29的降解过程中扮演了重要的角色。为了验证这一假说，作者使用MG132，一种泛素-蛋白酶体途径的特异性抑制剂处理神经元。WB结果表明，MG132处理使SNAP29的蛋白水平在氧糖剥夺后得到了恢复，但是这一处理并未显著影响再灌注过程中SNAP29的蛋白量（图1E-F）。以上的结果提示了在缺氧过程的早期阶段，SNAP29首先通过蛋白酶体途径遭到降解；而在缺氧后的再灌注过程中，Snap29的生物发生过程被抑制。这两个因素先后导致了氧糖剥夺再灌注过程中SNAP29蛋白量的下调。

接下来，作者探索了SNAP29是否在缺氧过程中发挥了神经保护作用。借助慢病毒载体在原代皮层神经元中将Snap29基因过表达（Lenti-CMV-Snap29），然后再对细胞进行氧糖剥夺处理。然而CCK和LDH测试结果都显示，过表达Snap29未能显著改善细胞的存活率（图1G-H）。基于此结果，我们得出结论，虽然在缺氧-再灌注过程中SNAP29蛋白水平被维持在一个较低的水平，但是这一变化与细胞的命运并无可靠的联系。

图1. OGD后，SNAP29蛋白表达量显著降低

02. 突触位点SNAP29的减少抑制了突触传递效率

为研究SNAP29的下降在缺血再灌注过程中的功能，作者采用免疫共沉淀的手段将正常状态和OGD状态下SNAP29的结合蛋白分离出来，并联合质谱分析鉴定出了这些蛋白。生物信息学的手段研究了在正常状态及OGD状态下表达发生改变的蛋白所处的生理过程和信号通路。一系列生物信息学分析提示，SNAP29相关的蛋白主要以蛋白-蛋白互作的形式在细胞的囊泡转运过程中发挥作用（图2）。

图2. 基因本体（Gene Ontology,GO）分析

为了验证生物信息学的结果，研究者首先研究了SNAP29蛋白与突触的标志物——突触素（synaptophysin）的共定位（图3A）。在缺血再灌注过程中，SNAP29斑点的数量出现了下降，同时SNAP29和突触素的共定位相比正常状态也出现了显著的减少（图3B-C）。这提示了SNAP29也许参与了突触前功能的调控。为了检验这一假说，作者借助慢病毒载体介导的小发卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）在培养神经元中敲减了SNAP29的表达量（图3D-E）。突触素和另一种突触前特异性标记物PSD95的共定位实验证实了SNAP29的敲减并没有破坏突触的超结构。而当过表SNAP29时，突触结中的突触前囊泡池的数量表现出了上升。

因为缺氧再灌注后多种生理过程都会发生变化，为了排除这些生理过程的影响，作者评价了使用shRNA敲减SNAP29是否能够模拟OGD后SNAP29在突触前的下调作用。作者使用SNAP29与突触素的荧光共定位情况指示SNAP29在突触前的积累量，通过计算SNAP29的积累指数（accumulation index），作者发现不论是OGD还是shRNA敲减之后，SNAP29在突触前的积累都发生了显著的下降（图3G）。

图3. OGD/R或敲低SNAP29导致SNAP29在突触位点的分布显著降低

03. SNAP29表达下调导致突触功能受损

接下来，作者使用SNAP29敲减的模型研究其对突触功能的影响。首先研究者使用全细胞膜片钳技术发现，SNAP29敲减显著地降低了AMPA受体介导的兴奋性突触后微小电流（mEPSCs）的频率，但并未显著改变其幅度（图4A-B）。这说明谷氨酸的突触传递受阻是由于突触前释放的影响所致。透射电镜的结果也显示，SNAP29敲减使突触前囊泡的分布更加分散，并显著降低了待释放囊泡池的大小（图4C-D），从而进一步提示SNAP29下调导致的突触功能受损是由于突触前释放功能障碍导致的。

体外的结果证实了氧糖剥夺-再灌注会降低SNAP29的蛋白水平，而SNAP29的降低则在突触功能中发挥了重要的作用。因此，研究人员进一步研究在大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion, MCAO）的小鼠中是否也会出现相同的影响。WB结果显示SNAP29的蛋白水平在MCAO造模后的半影区出现了显著的下降（图5A-B）。中动脉栓塞会影响多个脑区的功能，其中海马区作为认知功能的主要区域也是首当其冲。因此作者接下来检验了海马区结构和功能的损伤情况。为了在体内研究SNAP29下调对神经功能的影响，AAV病毒载体携带着Snap29的shRNA被注入到海马的CA1区。电镜下发现突触结构受损情况与体外培养的神经元类似（图5C）。

04. SNAP29表达下调损害长期神经投射导致认知障碍

接下来，作者借助光遗传的方式验证这一损伤是否会影响到神经环路的功能。作者将AAV-CMV-hChR2(H123R)-mCherry-U6-shRNA(Snap29) 注射小鼠海马CA1，并埋入光纤，光刺激的同时记录内侧前额叶皮层（mPFC）的场电位。结果发现光刺激诱发的场电位改变在mPFC被阻止，提示SNAP29的下调损伤了海马-前额叶皮层的通路（图6A-B）。同时，作者也测量了光刺激海马区后mPFC的δ，θ，β波以及γ波的功率，结果发现，SNAP29的表达下调可抑制由光刺激导致的所有相位功率上升的现象（图6C-D）。综上，SNAP29的下调损害了脑区间的通讯。

上文的研究证实了SNAP29敲减会损害神经元的长距离投射。接下来作者探究这种下降是否能够导致认知能力的损伤。借助旷场实验（图7A）发现，SNAP29敲减组小鼠停留在中间区域待的时间显著升高（图7C-E），这提示SNAP29的敲减鼓励小鼠进行探索并且显示出了对危险的漠视。随后，作者采用三箱社交实验观察动物的社交能力（图7B），结果发现，SNAP29敲减小鼠表现出社交记忆缺失的症状（图7F-H）。

最后，作者研究了SNAP29敲减对动物的学习记忆能力的影响。借助新物体识别行为学范式发现，SNAP29敲减组的小鼠明显花费了更多时间探索熟悉而非新物体（图8A-C）。而在Morris水迷宫实验中，SNAP29敲减组小鼠表现出明显的学习和记忆功能障碍（图8D-I）。以上的结果表明，SNAP29表达下调显著地损伤了小鼠的认知和记忆功能。

本文作者通过构建OGD模型发现在脑卒中发生过程中SNAP29蛋白减少，随后，借助生物信息学分析、分子生物学技术，发现卒中发生后SNAP29蛋白在突触结构中显著降低，并通过病毒载体介导的基因功能丢失的方法构建SNAP29蛋白敲减模型，发现突触前囊泡的分布分散、待释放囊泡池面积减小导致突触功能障碍。最后，研究人员通过构建MCAO模型，配合行为学范式，观察到在海马CA1区敲减SNAP29蛋白导致小鼠社交认知功能障碍。该发现进一步揭示了卒中后认知障碍的发病机制，为卒中后认知功能障碍的靶向治疗提供了可能的干预靶点。