高通量测序揭示了炎症和血管壁损伤在脑动静脉畸形中的关键作用 - 脑医汇 - 神外资讯

来自荷兰乌德勒支大学医学中心神经外科的Allard J. Hauer等应用高通量测序方法，在转录水平上比较脑动静脉畸形（BAVMs）组织与对照颅内动脉组织的基因差异表达。

——摘自文章章节

【Ref：Hauer AJ, et al. Stroke. 2020 Jan;51(1):268-274. doi: 10.1161/STROKEAHA.119.025657.】

研究背景

脑动静脉畸形（BAVMs）是儿童和青年颅内出血的重要原因。目前的治疗方式包括手术切除、介入栓塞以及立体定向放射治疗，其首要目的是预防出血。然而，这些治疗也存在严重并发症的风险。因此，从研究BAVMs的发生机制入手，寻找有效药物降低BAVMs破裂风险，是目前BAVMs相关基础研究亟待解决的关键科学问题。

最近，两项研究发现了散发性BAVMs的内皮细胞中出现了来源于RAS癌基因组中的KRAS和BRAF基因的体细胞突变。然而，导致畸形团出血的分子机制尚不完全清楚。越来越多的证据认为BAVMs是一种动态变化的病变，包括血管壁的持续重构和炎症细胞的浸润。迄今为止，已有4项针对BAVMs的小样本基因芯片表达谱研究，发现了19到1781个差异表达基因。然而，这些研究存在方法学问题，诸如使用不同类型的对照样本，包括颞浅动脉、皮质动脉、BAVMs引流静脉以及脑海绵状血管瘤，这些问题使得研究无法得出明确的结论。

RNA二代高通量测序可以提供比芯片更准确、灵敏、可靠的基因表达数据，分析阐明BAVMs的基因表达谱可能对开发新的治疗策略提供帮助。因此，来自荷兰乌德勒支大学医学中心神经外科的Allard J. Hauer等应用高通量测序方法，在转录水平上比较BAVMs组织与对照颅内动脉组织的基因差异表达，结果发表在2020年1月Stroke杂志上。

研究方法

1、病例和对照

收集2010年至2013年在乌德勒支大学医学中心神经外科确诊为BAVM并行外科切除的12例BAVM组织样本。排除患遗传性出血性毛细血管扩张等相关遗传性疾病的患者。BAVM均由DSA诊断。手术指征包括11例BAVM出血和1例癫痫。对照样本来自16例药物难治性癫痫患者行颞叶切除获得的颅内皮质动脉。在这些对照患者中，从切除后含有癫痫病灶的脑组织中获得的正常外观的皮质动脉。BAVM和对照组织样品在切除后立即放入液氮中并储存在-80℃。

2、文库制备和RNA测序

样本进行RNA抽提，质控合格后使用Illumina公司的HiSeq2500测序仪构建cDNA文库。

3、基因差异表达谱分析

对测序数据进行标准化，去除低质量的数据，利用生物信息学技术比对序列并进行差异表达谱分析。

4、自身验证

选出差异表达最明显的前10个基因，选择6个基因进行验证，并另外选择了4个感兴趣基因进行验证。使用ddPCR技术检测相关基因的表达水平。

5、差异基因功能及通路富集分析

为了了解差异基因富集的生物功能和相关通路，进行了KEGG（评估显著富集通路）和GO（评估显著富集的生物过程、细胞组件和分子功能）分析。

6、验证已有BAVMs相关基因和信号通路

对BAVMs相关致病基因（KRAS，BRAF，ENG，ACVRL1 [ALK1]，SMAD4，RASA1和EPHB4）是否存在差异表达进行检测。鉴于散发性BAVMs和遗传性出血性毛细血管扩张在临床表现上的相似性，还研究了在遗传性出血性毛细血管扩张中发挥关键作用的TGF-β/BMP信号传导通路的差异表达情况。此外，由于一些血管生成因子在BAVM病理生理过程中的作用，还研究了Notch-1和血管新生信号通路（包括VEGF和血管生成素-TIE系统）是否存在差异表达。

研究结果

1、患者临床特点见表1

表1. BAVM患者的临床和影像学特征

2、差异基因表达谱

BAVM标本和对照动脉之间有1234个基因差异表达（图1和2）。其中，736（59.6％）在BAVMs中上调，498（40.4％）基因下调。基因表达差异倍数的中位数为1.46（0.45-5.62）。

表2中显示差异表达最明显的前10个基因。其中2个上调基因（MYRF和MBP）参与轴突髓鞘的形成，2个上调基因（CHIT1和LTF）与炎症相关。CHIT1编码壳三糖苷酶，它是由激活的巨噬细胞产生。LTF编码乳运铁蛋白，由嗜中性粒细胞的分泌颗粒释放。下调的DDR2基因编码酪氨酸激酶受体参与调控细胞生长、分化和代谢。其它上调基因中，ZMYND10、CFAP43和C9orf117参与一些细胞骨架包括轴丝动力蛋白的微管运动功能，SLC47A2编码参与（毒性）代谢物和运动纤毛排出的转运蛋白。

图1. 火山图。红色表示BAVMs显著上调基因，绿色表示显著下调基因，黑色表示没有差异表达基因。

图2. 热图。对脑动静脉畸形（BAVMs）与对照样本差异表达的1234个基因进行无监督聚类分析结果。绿色表示相对表达高于平均值的基因，红色表示相对表达低于平均值的基因。

表2. 差异表达最显著的10个基因

3、自身验证

ddPCR确认了6个差异表达基因（ZMYND10，DDR2，CFAP43，SLC47A2，CHIT1，和LTF）（表2）。另外检测的4个感兴趣的基因中，IL1A确认存在差异，但ROCK1、COL5A2、和SMAD4无差异。

4、功能通路富集分析

针对1234个差异表达基因进行功能分析，结果显示BAVMs与蛋白消化和吸收通路显著相关，此通路主要包括编码胶原蛋白家族的基因下调。而在经过FDR校正后，粘着斑和细胞外基质受体两个生物学通路无显著相关性（P = 9.15×10^-2， P = 9.72×10^-2），这些通路主要编码细胞外基质（ECM）组分，包括多个整合蛋白和胶原蛋白、硫酸肝素、纤连蛋白和层粘连蛋白等基因的下调。GO分析中确定了47个富集的GO条目，包括轴突装配、肌动球蛋白和微管细胞骨架、细胞运动和迁移、细胞外基质、血管平滑肌细胞、电压门控（离子）通道以及（金属离子）的跨膜转运。

5、已有BAVMs相关基因和信号通路验证结果

结果显示BAVMs组织中SMAD4基因表达下调，后者能够编码TGF-β信号传导通路的下游细胞内效应器并调节转录。其他已知的BAVMs相关基因（KRAS、BRAF、ENG、ACVRL1、RASA1和EPHB4）没有显示差异表达。通过分析经典的TGF-β/ BMP信号传导通路，发现了一些其他基因在BAVMs内表达降低，包括编码用于潜在结合蛋白、跨膜受体、细胞内效应器以及转录因子的基因。

研究发现VEGF和他的受体以及Notch-1信号通路相关基因均无差异表达。与此相反，研究发现酪氨酸激酶受体（TEK，也称TIE-2）在BAVMs中表达下调。此外，维持内皮细胞稳态的ANGPT1（ANG1）基因在BAVMs表达下调，而它的竞争性抑制剂，促血管生成的TIE-2受体拮抗剂ANGPT2基因在BAVMs中并没有表达上调。

研究结论

研究结果显示，BAVMs中细胞骨架蛋白驱动基因以及编码嗜中性粒细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子和其他产物的基因表达上调，表明炎症介质在BAVMs中的作用。ECM复合物、血管生成素-TIE系统以及TFG-β信号通路相关基因表达下调。表明BAVMs的发展破裂可能与细胞骨架迁移能力、血管壁结构、跨膜转运以及内质网的相关通路相关。

本研究探索了BAVMs在转录组水平的基因表达情况，发现了炎症、脑血管新生和管壁完整性受损在BAVM发展破裂这一系列病理生理过程中起到的重要作用。但这些结果仍需要进一步研究进行外部验证。BAVMs涉及的这些病理过程似乎是相互关联的，但需要阐明其确切的相互作用机制。同时，本研究发现的一些基因和信号传导通路已经BAVMs多种细胞学研究中所涉及。因此，将来的功能研究可以更具体集中在不同的细胞组分和它们的相互作用关系。本研究能够对探索药物治疗BAVMs提供研究方向，包括促进血管成熟、抗炎以及免疫修饰的药物。

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