肿瘤的免疫治疗发展很快，但对脑肿瘤需要考虑中枢神经系统特殊的免疫微环境；药物不能有效越过血脑屏障（BBB）是治疗脑肿瘤疗效不佳的部分原因。美国洛杉矶Cedars-Sinai医学中心神经外科纳米医学研究中心的Anna Galstyan等发现，利用β-L-羟基丁二酸（PMLA）为载体构建搭载免疫检查点抑制剂CTLA-4和PD-1抗体的纳米免疫复合物（NICs）能够有效穿越血脑屏障并诱导胶质瘤的局部免疫反应。研究结果发表在2019年8月的《Nature Communication》杂志。

研究者在体外合成纳米免疫复合物（NICs），以PMLA作为载体，分别将CTLA-4和PD-L1单克隆抗体共价结合于PMLA上。同时，这个载体搭载不同比例的甲氧基聚乙二醇5000（mPEG5000）保证其溶解度和稳定性，利用抗鼠转铁蛋白受体（TfR）抗体保证其穿越血脑屏障的能力和三亮氨酸（LLL）防止PMLA水解。

接着，采用鼠胶质母细胞瘤GL-261细胞系构建小鼠颅内胶质瘤模型。用红色荧光染料罗丹明（rhodamine）分别标记NICs和单一抗体，给小鼠静脉注射。4小时后，采用鼠脑切片荧光和细胞免疫荧光染色观察药物在脑内分布情况，评估NICs和单一抗体穿越血脑屏障的能力。相比于单一抗体，NICs在肿瘤区域和血管外的荧光信号更强，说明NICs具有更好的穿越血脑屏障的能力（图1）。

图1. 荧光标记的NICs跨越血脑屏障能力和胶质瘤内部蓄积状况。

随后，应用NICs和单一抗体分别治疗载瘤小鼠，通过流式细胞计数技术测定肿瘤细胞中不同种类的T细胞和Ki67阳性细胞数，研究药物到达肿瘤引起局部免疫反应的情况。NICs治疗组中，肿瘤细胞的CD3、CD4、CD8+T细胞和调节性T细胞比单一抗体治疗组明显增加；同时，CD4+/Ki67+细胞和CD8+/Ki67+细胞也明显增多，证明NICs治疗组有更多的免疫细胞进入肿瘤内部。

为进一步研究肿瘤内局部免疫反应，研究人员采用细胞免疫荧光以及流式细胞计数技术分析肿瘤细胞中CD8+和CD4+/FOXP3+细胞。NICs治疗组中CD8+荧光信号更强，流式细胞计数分析也显示CD8+细胞数更多；而CD4+/FOXP3+荧光信号弱，流式细胞计数分析也显示CD4+/FOXP3+少。脑肿瘤中免疫反应的激活导致肿瘤巨噬细胞的增加。M1型肿瘤巨噬细胞增加，产生大量抗肿瘤的M1肿瘤巨噬细胞标记物（iNOS），提升杀伤肿瘤的效应，促进抗肿瘤反应。

作者应用流式细胞计数测定不同种类肿瘤内的巨噬细胞数。NICs治疗组M1肿瘤巨噬细胞数比单一抗体组显著增高；M2肿瘤巨噬细胞比单一抗体治疗组无明显差异；NK细胞比单一抗体治疗组显著增高。研究者进一步利用免疫荧光染色分析抗肿瘤的M1肿瘤巨噬细胞标记物iNOS的表达情况。NICs治疗组iNOS表达量比单一抗体治疗组表达显著增加。

最后，研究者使用不同NICs与单一抗体对GL-261细胞系构建的小鼠颅内胶质瘤模型进行治疗，观察实验动物生存情况。结果证实联合应用NICs治疗可以显著延长载瘤小鼠生存期。

图2. NICs能够有效延长GL-261胶质瘤模型小鼠生存期。

综上所述，该实验研究证实，以PMLA作为载体搭载CTLA-4和PD-L1单克隆抗体的合成纳米免疫复合物（NICs），对小鼠脑内胶质瘤模型有治疗作用；为脑内恶性肿瘤的治疗开辟新途径。