Nature---昼夜节律影响中风治疗效果？这篇Nature文献揭示神经保护疗法的潜在转化困境 - 脑医汇 - 神外资讯

大家好，今天带来一篇《Nature》期刊上的重要研究分享。文章探讨了一个影响脑中风治疗成败的关键因素——昼夜节律。研究指出，啮齿类动物与人类的昼夜节律差异，可能是导致神经保护疗法在临床试验中屡屡失败的重要原因。接下来，咱们详细看看这篇文献的实验设计和结果。

背景介绍：动物实验与临床不一致的谜团

多年来，许多神经保护疗法在啮齿类动物（如老鼠、大鼠）模型中取得了显著效果，但在人体临床试验中却未能复制这些成功。研究者认为，昼夜节律（生物钟）可能是影响治疗效果的一个被忽视的关键因素。动物和人类的昼夜节律不同，啮齿动物是夜行动物，而人类则在白天活跃。这种生物节律的差异可能导致实验结果难以直接转化到临床应用中。

研究设计：三种神经保护疗法的详细实验

研究团队测试了三种不同的神经保护疗法，分别在啮齿类动物的“活动期”（夜晚）和“非活动期”（白天）进行实验，以观察疗效的昼夜差异。

1. 常压氧疗法（NBO）：通过给啮齿动物提供100%的氧气来减少脑梗死体积。

2. 自由基清除剂α-苯基丁基氮化物（αPBN）：用于减少中风后自由基对脑组织的损伤。

3. NMDA受体拮抗剂MK801：通过阻断NMDA受体，减少神经元的过度兴奋和死亡。

图1展示了神经保护在啮齿类动物脑中风模型中的表现，以及昼夜节律如何影响实验结果和人类临床试验结果的对比

1. 图1a：展示了昼夜节律在啮齿类动物与人类中的差异。图中标明，啮齿类动物的昼夜节律与人类相反：啮齿类动物在夜间处于“活动期”，而人类在白天处于“活动期”。这意味着大多数啮齿类动物实验是在它们的“非活动期”（白天）进行，而临床试验则是在人类的“活动期”（白天）进行的中风患者中开展，这种差异可能导致实验结果无法有效转化到临床。

2. 图1b：该图展示了常压氧疗法（NBO）在大鼠模型中的实验结果。实验对大鼠进行了100分钟的中脑动脉闭塞（MCAO）手术，NBO组接受了100%氧气治疗，控制组仅接受了30%氧气治疗。结果显示，NBO在大鼠的“非活动期”（白天）显著降低了脑梗死体积（左侧图），但在“活动期”（夜晚）则未能取得同样的效果（右侧图）。此外，研究还发现，实验在“活动期”中脑梗死体积相对较小，这表明夜间大鼠的脑损伤可能更小。

3. 图1c：为了排除梗死体积过小导致NBO在“活动期”无效的可能性，研究团队使用了更温和的60分钟中风模型。结果再次表明，NBO依然只能在“非活动期”降低脑梗死体积（左侧图），在“活动期”中则无效（右侧图）。

4. 图1d：该图展示了自由基清除剂α-苯基丁基氮化物（αPBN）在小鼠模型中的实验结果。在60分钟中风模型中，αPBN同样仅在“非活动期”有效降低了脑梗死体积（左侧图），而在“活动期”无效（右侧图）。

5. 图1e：该图展示了NMDA受体拮抗剂MK801在小鼠模型中的实验结果。MK801在“非活动期”有效减少了永久性中风模型中的脑梗死体积（左侧图），但在“活动期”中却无效（右侧图）。

6. 图1f：作为对照实验，研究团队比较了“非活动期”和“活动期”中，60分钟暂时性中风和永久性中风两种不同模型下的梗死体积。结果显示，梗死体积在这两种模型中均较小，但与前面的发现一致，常规的神经保护疗法在“活动期”中效果不佳。

总结：图1展示了昼夜节律对神经保护疗法疗效的显著影响，无论是常压氧疗法（NBO）、自由基清除剂αPBN还是NMDA受体拮抗剂MK801，这些治疗都在啮齿类动物的“非活动期”（白天）有效，而在它们的“活动期”（夜晚）疗效不佳。这说明昼夜节律的不同是导致这些疗法从动物实验到临床试验转化失败的重要原因之一。

实验结果一：常压氧疗法的昼夜节律差异

研究首先在大鼠模型中使用了常压氧疗法（NBO）。实验在大鼠的“非活动期”（白天）进行时，NBO显著降低了脑梗死体积，减少了缺血损伤。然而，当实验在大鼠的“活动期”（夜晚）进行时，NBO的效果几乎消失。也就是说，NBO在夜晚无法提供同样的脑保护效果。

为了确保结果的可靠性，研究团队在不同的实验条件下重复了实验。例如，采用不同的缺血模型（中风持续60分钟和100分钟），以及切换光照周期后进行实验，结果依然显示了类似的昼夜节律差异。**白天（非活动期）**的实验中，NBO依然能够减少梗死面积，但在夜间（活动期）却无效。

实验结果二：αPBN和MK801的昼夜节律影响

接下来，研究团队在小鼠模型中测试了αPBN和MK801这两种神经保护疗法。结果显示，与NBO相似，αPBN和MK801在小鼠的“非活动期”（白天）能够显著降低脑梗死体积，但在“活动期”（夜晚）则未能展现出同样的效果。

通过进一步分析，研究发现，在小鼠“活动期”发生中风时，缺血半暗带区域较小，神经元死亡率更低，这可能是导致治疗效果差异的一个关键因素。在“活动期”中，神经元的损伤程度较轻，治疗干预的效果自然也不如“非活动期”那样显著。

实验结果三：激光斑点成像揭示半暗带变化

为了进一步验证这些结果，研究团队使用了激光斑点成像技术，分析了小鼠中风后的脑血流变化。结果显示，在小鼠的“活动期”（夜晚）发生中风时，脑部的缺血半暗带（即部分血流得以保持的区域）比“非活动期”要小得多。此外，“活动期”中的半暗带区域出现的细胞死亡率较低，梗死区域扩展得也更慢。

这些发现揭示了一个重要问题：在“活动期”，中风后可治疗的脑组织区域更少，因而神经保护疗法的有效性下降。这可能解释了为什么许多神经保护疗法在动物实验中有效，但在临床试验中却无法获得同样的成功。

实验结果四：体外实验支持昼夜节律假设

为了进一步研究昼夜节律对神经元损伤的影响，研究团队还进行了体外实验，模拟了神经元的昼夜节律。实验表明，缺氧和葡萄糖剥夺在小鼠神经元的“活动期”触发的神经元死亡显著少于“非活动期”。此外，“活动期”中的神经元释放的谷氨酸和**活性氧（ROS）**也较少，这进一步支持了神经元在“活动期”受损较轻的假设。

总的来说，这些体外和体内实验结果都表明，昼夜节律影响神经元对缺血损伤的易感性，并且影响神经保护疗法的效果。

图2展示了昼夜节律如何影响脑缺血后半暗带（penumbra）的变化，并揭示了昼夜节律对中风后脑部血流、梗死生长和细胞死亡的影响。

1. 图2a：展示了通过**激光斑点成像（Laser Speckle Imaging）**在中风后不同时段（ZT5–7和ZT17–19）的脑血流分布。ZT5–7表示“非活动期”（白天），ZT17–19表示“活动期”（夜晚）。成像结果显示，在“活动期”（ZT17–19）的脑血流梯度（从健康区域到缺血区域的过渡）更陡峭，而在“非活动期”（ZT5–7）的血流梯度相对平缓。这意味着“活动期”的缺血半暗带区域（介于正常血流与缺血核心之间的区域）比“非活动期”更狭窄。

2. 图2b：该图定量分析了激光斑点成像中血流梯度的变化。左侧图展示了不同脑部区域的血流变化，表明ZT17–19（活动期）小鼠的血流衰减得更快。右侧图则进一步定量比较了不同时间段下的血流变化，发现“活动期”小鼠的血流减少速度更快，缺血半暗带区域（定义为血流保持在30–50%正常水平的区域）更狭窄。

3. 图2c：进一步比较了缺血半暗带的宽度，图中显示，“活动期”小鼠的半暗带明显比“非活动期”更窄。缺血半暗带是神经保护治疗的主要靶区，通常是神经元有可能存活的区域。较小的半暗带意味着“活动期”中风的可治疗区域更小，治疗难度也更大。

4. 图2d：该图展示了脑梗死体积在12至72小时内的增长情况。结果表明，虽然脑梗死体积在72小时后都有所增加，但“活动期”小鼠的梗死体积增长较慢。这与前面发现的半暗带更小一致，暗示了在“活动期”大脑受到的损伤可能较轻。

5. 图2e：该图展示了中风后24小时内的细胞死亡情况。通过TUNEL和fluoro-jade染色技术标记死亡细胞，图中显示了“非活动期”（ZT3–9）与“活动期”（ZT15–21）小鼠的脑组织切片。可以看到，“活动期”小鼠的缺血半暗带区域内的TUNEL阳性细胞（死亡细胞）更少，这表明细胞死亡在“活动期”更不活跃。

6. 图2f：进一步定量分析了细胞死亡率，比较了“非活动期”和“活动期”小鼠的细胞死亡情况。结果显示，在“活动期”中的半暗带区域，TUNEL阳性细胞和fluoro-jade阳性细胞的比例明显较低，这意味着“活动期”小鼠的细胞死亡较少，脑损伤扩展速度较慢。

总结：

图2展示了昼夜节律如何影响中风后脑部的病理变化，特别是缺血半暗带的大小、脑梗死体积的增长以及细胞死亡情况。研究发现，在啮齿动物的“活动期”（夜晚），缺血半暗带区域较小，脑梗死体积增长较慢，且细胞死亡率较低，这意味着脑损伤较轻。这些结果揭示了为什么在“活动期”进行的实验中，神经保护疗法的效果可能较差，因为可治疗的半暗带区域较小。图2的结果进一步证明，昼夜节律是神经保护疗法有效性的关键因素，并强调了未来在设计中风治疗实验时，必须考虑昼夜节律对病理过程的影响。

图3展示了昼夜节律如何影响体外神经元对缺氧和葡萄糖剥夺（OGD）的响应，以及神经保护疗法的效果，进一步揭示了昼夜节律在神经元死亡机制中的作用。

1. 图3a：展示了通过地塞米松诱导的小鼠神经元的昼夜节律基因表达。研究人员使用地塞米松模拟昼夜节律，诱导神经元中的Per1和Per2基因的表达，这些基因通常在昼夜节律中起关键作用。在6小时后，Per1和Per2表达上升，对应于“活动期”；而在12小时后，Per1和Per2表达下降，对应于“非活动期”。这为后续实验提供了昼夜节律的体外模型。

2. 图3b：展示了实验设计流程。神经元被暴露于缺氧和葡萄糖剥夺（OGD）条件下，分别在“活动期”和“非活动期”添加神经保护疗法αPBN或MK801进行处理，随后再进行24小时的再氧化，以评估细胞存活率。

3. 图3c：展示了αPBN对神经元的保护效果。在缺氧和葡萄糖剥夺条件下，αPBN仅在“非活动期”有效减少了神经元死亡（图中“Dex 12 h”），而在“活动期”（图中“Dex 6 h”）中效果不明显。这与体内实验的结果一致，表明神经保护效果依赖于昼夜节律。

4. 图3d：展示了MK801对神经元的保护效果。与αPBN类似，MK801在“非活动期”能够有效减少神经元死亡，而在“活动期”中无显著效果。这进一步证明了神经保护疗法的效果受昼夜节律的影响。

5. 图3e：展示了在缺氧和葡萄糖剥夺后，神经元的谷氨酸释放和活性氧（ROS）生成。实验发现，在“活动期”，神经元释放的谷氨酸和产生的ROS明显少于“非活动期”。谷氨酸和ROS是神经元死亡的重要介质，较低的释放量表明“活动期”神经元的损伤机制可能较轻。

6. 图3f-h：展示了OGD诱导的神经元细胞死亡机制。实验分析了凋亡和坏死的相关信号分子（如caspase-3和RIP3激酶）的激活情况。结果表明，在“活动期”，这些死亡信号的激活程度较低，表明神经元在“活动期”不容易经历凋亡和坏死。这进一步解释了为什么神经保护疗法在“活动期”效果较差。

7. 图3i：展示了对多种细胞死亡机制进行联合阻断后的神经元存活情况。即使阻断了多种活性细胞死亡通路（如NMDA受体、AMPA受体、ROS、凋亡和坏死等），在“活动期”的神经元仍表现出更强的抗神经保护抵抗性，这表明“活动期”神经元的损伤机制不同，难以通过传统的神经保护策略进行干预。

总结：

图3揭示了昼夜节律对神经元响应缺氧和葡萄糖剥夺的影响，显示“非活动期”神经元对神经保护疗法更敏感，而“活动期”的神经元损伤较轻，且对保护疗法的反应较差。这些结果支持了昼夜节律在中风等疾病治疗中的重要性，并强调了未来研究需要在合适的生物钟背景下进行，以提高神经保护疗法的有效性。

临床启示：重新思考昼夜节律在治疗中的作用

这篇文献的重要启示在于，昼夜节律差异可能是动物实验和人体临床试验结果不一致的重要原因。在临床试验中，绝大多数中风患者的发病时间集中在白天（即人类的“活动期”），而动物实验往往是在啮齿动物的“非活动期”进行的。这种实验与临床实际的昼夜错位，可能导致了实验结果无法成功转化到临床应用。

对未来的展望

为了提高未来神经保护疗法的临床转化成功率，研究人员建议，未来的动物实验设计应当更加关注昼夜节律的影响，选择与人类节律相匹配的时间段进行实验。这将有助于更好地模拟临床中患者的生理状态，为神经保护疗法的开发和优化提供更有力的实验依据。

通过重新思考实验设计中的昼夜节律问题，科学家们或许能够找到更有效的脑中风治疗方法，真正实现从实验室到临床的转化，为中风患者带来福音。

参考文献Esposito et al., 2020, Nature (https://doi.org/10.1038/s41586-020-2348-z)

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